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SGLT2选择性抑制剂筛选及药效评价方法建立
本研究的目的是建立SGLT2选择性抑制剂筛选及药效学评价体系.分别将人全长SGLT2和SGLT1cDNA连接至pMSCVpuro载体并转染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞,RT-PCR、Western blot或细胞免疫荧光染色检测目的基因、蛋白在细胞中的表达.采用荧光标记的1-脱氧葡萄糖(1-[Ⅳ-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-1-deoxy-D-glucose,1-NBDG)作为底物进行葡萄糖转运实验,检测模型细胞的Na+依赖的葡萄糖摄取功能,并对阳性药达格列净、根皮苷选择性进行评价.后,进行整体药效评价,观察达格列净对正常小鼠及四氧嘧啶诱导的T1DM小鼠血糖的影响.结果显示pMSCVpuro-SGLT1转染组细胞SGLT1基因及蛋白水平均显著升高,pMSCVpuro-SGLT2转染组SGLT2蛋白高表达于细胞膜及细胞质,说明SGLTl/SGLT2稳定过表达细胞构建成功.葡萄糖转运实验结果显示,与pMSCVpuro-null转染组相比,pMSCVpuro-SGLT1、pMSCVpuro-SGLT2转染组细胞Na+依赖性1-NBDG摄取明显增高.达格列净具有良好的选择性,对SGLT1的半数抑制浓度(IC50,6.20×10-7 mol·L-1)远高于对SGLT2抑制的IC50值(2.24×10-10 mol·L-1),优于非选择性抑制剂根皮苷.达格列净单次给药即可改善正常小鼠葡萄糖耐量.对T1DM小鼠,达格列净从给药后lh血糖水平即显著降低,能够剂量依赖地降低0～24h血糖-时间曲线下面积.连续给药20天,能够较平稳地降低小鼠餐后血糖.本研究建立了较完善的SGLT2选择性抑制剂的体外筛选方法和整体药效学评价方法.该方法具有无同位素污染,高转运效率、良好稳定性等优点,将为新的SGLT2高选择性抑制剂研发提供良好的技术平台.
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西藏药用植物螃蟹甲可培养内生真菌的分离、鉴定及抗HIV-1整合酶链转移活性研究
从西藏药用植物螃蟹甲(Phlomis younghusbandii Mukerjee)的叶和茎中分离得到52株内生真菌.经分子鉴定(基于ITS序列和28S序列),内生真菌分属于Phoma、Chaetosphaeronema、Fusarium、Leptosphaeria 等12属,其中拟茎点霉属(Phoma)为其优势菌群.使用原核表达的可溶型一型人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)的整合酶(integrase,IN),对52株内生真菌的发酵产物进行体外抗HIV-1 整合酶链转移反应活性试验,结果发现,来自Chaetosphaeronema属真菌的7个样品对整合酶链转移反应表现出强烈的抑制作用,其对应的IC50值分别为6.60、5.20、2.86、7.86、4.47、4.56和3.23 μtg·mL-1.该研究表明,螃蟹甲内生真菌在发现抗HIV-1整合酶活性物质方面有进一步的开发价值.
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基于BODIPY母核的羧酸酯酶1特异性荧光探针底物的设计研发
羧酸酯酶1 (carboxylesterase 1,CE1)是哺乳动物体内分布的一种重要的丝氨酸水解酶,广泛参与多种内外源性酯类化合物(包括胆固醇酯等内源物,以及酯类药物及杀虫剂等外源物)的水解代谢.本研究基于人羧酸酯酶1 (hCE1)偏好底物的结构特征,选取8-羧酸-BODIPY为荧光母核,设计合成了4种BODIPY-8-羧酸酯衍生物,进而通过单酶筛选和酶抑制实验考察了hCE1催化4种酯类底物的特异性.研究发现,BODIPY-8-羧酸酯的醇基部分越小,hCE1对底物的选择性越高,BODIPY-8-羧酸甲酯(BCM)和BODIPY-8-羧酸乙酯(BCE)均可以作为hCE1的特异性荧光探针底物.在此基础上,选择了水解速率更快的BCM为hCE1探针底物,进一步考察了BCM在人肝微粒体(HLM)和hCE1单酶中的水解动力学,并借助该底物开展了hCE1抑制剂的高效表征研究.研究发现BCM在HLM和hCE1中的酶动力学行为及Km值非常接近,表明hCE1是HLM中参与BCM水解的主要代谢酶.此外,抑制剂表征实验表明BCM可用于hCE1抑制剂的高效筛选与评价,且可用HLM代替hCE1单酶进行酶抑制剂的筛选与评价.
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从天然产物筛选SIRT5抑制剂
目的:针对潜在肿瘤治疗靶点sirtuin5(SIRT5),从天然产物中筛选出SIRT5抑制剂.方法:利用SIRT5的去琥珀酰化酶反应活性,建立HPLC活性检测方法,并对已有天然产物库进行SIRT5抑制剂的筛选以及IC50的测定.结果:发现含羧基的刺囊酸、齐墩果酸的IC50值分别为40和70 μmol·L-1.结论:齐墩果酸、刺囊酸等天然产物对SIRT5具有较显著的抑制活性,为进一步的SIRT5靶向药物化学研究奠定了基础.
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酶抑制剂筛选的研究进展
20世纪60年代初,Umezawa提出了酶抑制的概念,从而将抗生素的研究扩大到酶抑制剂的新领域.
