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SGLT2选择性抑制剂筛选及药效评价方法建立
本研究的目的是建立SGLT2选择性抑制剂筛选及药效学评价体系.分别将人全长SGLT2和SGLT1cDNA连接至pMSCVpuro载体并转染HEK293细胞,嘌呤霉素筛选单克隆细胞,RT-PCR、Western blot或细胞免疫荧光染色检测目的基因、蛋白在细胞中的表达.采用荧光标记的1-脱氧葡萄糖(1-[Ⅳ-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino]-1-deoxy-D-glucose,1-NBDG)作为底物进行葡萄糖转运实验,检测模型细胞的Na+依赖的葡萄糖摄取功能,并对阳性药达格列净、根皮苷选择性进行评价.后,进行整体药效评价,观察达格列净对正常小鼠及四氧嘧啶诱导的T1DM小鼠血糖的影响.结果显示pMSCVpuro-SGLT1转染组细胞SGLT1基因及蛋白水平均显著升高,pMSCVpuro-SGLT2转染组SGLT2蛋白高表达于细胞膜及细胞质,说明SGLTl/SGLT2稳定过表达细胞构建成功.葡萄糖转运实验结果显示,与pMSCVpuro-null转染组相比,pMSCVpuro-SGLT1、pMSCVpuro-SGLT2转染组细胞Na+依赖性1-NBDG摄取明显增高.达格列净具有良好的选择性,对SGLT1的半数抑制浓度(IC50,6.20×10-7 mol·L-1)远高于对SGLT2抑制的IC50值(2.24×10-10 mol·L-1),优于非选择性抑制剂根皮苷.达格列净单次给药即可改善正常小鼠葡萄糖耐量.对T1DM小鼠,达格列净从给药后lh血糖水平即显著降低,能够剂量依赖地降低0～24h血糖-时间曲线下面积.连续给药20天,能够较平稳地降低小鼠餐后血糖.本研究建立了较完善的SGLT2选择性抑制剂的体外筛选方法和整体药效学评价方法.该方法具有无同位素污染,高转运效率、良好稳定性等优点,将为新的SGLT2高选择性抑制剂研发提供良好的技术平台.
