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一例HIV-1急性感染者奠基病毒的gp160基因序列特征及其假病毒构建
目的 观察急性感染期艾滋病病毒Ⅰ型(HIV-1) gp160的全长基因序列及感染特征.方法 从一例处于Feibig Ⅰ期HIV-1感染者血浆中提取RNA,扩增gp160全长基因并测序,分析其生物学信息;将gp160全长基因与pcDNA3.1His/V5真核表达载体连接,构建Env-pcDNA3.1真核表达质粒,与骨架质粒pNL4-3.Luc.R-E-共转染293细胞,包装出假病毒.用包装的假病毒感染ghost细胞,测定感染细胞的荧光素酶活性(RLU),鉴定假病毒的感染活性.结果 成功扩增出gp160全长基因,嗜性预测为CCR5,N-糖基化位点数与标准株HXB2相同,但gp120糖基化程度更高,氨基酸变异主要集中在V1～V5区.假病毒感染试验显示,RLU值达到7log.结论 获得了处于急性感染期的HIV-1 gp160基因序列和高感染活性的假病毒.
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表达HIV-1 gp160膜蛋白靶细胞的制备及鉴定
目的获得表达HIV-1 bp160膜蛋白的靶细胞,用于HIV-1特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)和抗HIV-1重组毒素细胞杀伤活性检测.方法采用PCR方法,从质粒pJen 10中扩增HIV-1 gp160基因,插入pGEM-T 载体,测序后克隆入pIRES1 ngo载体中构建成重组质粒pIRE160,酶切鉴定正确后,转染人肝癌细胞(SMMC-7721),G418加压筛选至细胞不再死亡为止,并采用Western blot和间接免疫荧光法对制备的靶细胞进行检测.结果HIV-1 gp160在SMMC7721表面表达,并裂解为gp120和gp41蛋白.结论已成功得到稳定表达HIV-1 bp160的靶细胞,且表达的蛋白具有良好的特异性.
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序贯联合应用HIV-1 gp160腺病毒载体疫苗的体液免疫效果研究
目的 探讨序贯联合应用Ad5-HIVgp160疫苗与其他艾滋病疫苗所诱导的特异性体液免疫反应效果.方法 用Ad5-HIVgp160疫苗、其他腺病毒载体和腺病毒相关载体疫苗以不同免疫程序分别免疫豚鼠,通过ELISA和中和实验方法检测其诱导的免疫反应,比较疫苗联合免疫组豚鼠与疫苗单独免疫组豚鼠诱导的体液免疫反应的强度.结果 不同免疫程序的豚鼠均能检测到针对HIV gp120的HIV结合抗体和针对HIV敏感株sf162的中和活性;联合疫苗组诱导的gp120特异性抗体滴度和病毒中和活性高于单独免疫组,但无显著性差异.结论 Ad5-HIVgp160疫苗单独或与其他疫苗联合使用均能诱导高水平的体液免疫反应,能激发针对HIV敏感株产生中和活性的抗体.
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HIV-1功能性膜蛋白基因gp160的快速筛选和鉴定
目的 应用假病毒感染实验快速筛选可用于HIV-1中和抗体测定的功能性膜蛋白基因.方法 从HIV感染样品中扩增全长膜蛋白基因gp160,通过系统进化树分析确定其基因亚型,将HIV-1gp160阳性克隆与pSG3△Env质粒共转染293T细胞制备假病毒并对其感染能力进行分析,筛选功能性膜蛋白基因.结果 克隆和鉴定了我国HIV-1流行毒株的9个功能性膜蛋白基因,系统进化树分析表明其中包括4个CRF07_BC、2个CRF01_AE和3个B亚型毒株,这些gp160膜蛋白基因所制备的假病毒具有良好的感染性.结论 不同亚型HIV-1功能性膜蛋白gp160克隆为选择HIV-1中和抗体测定毒株提供了有价值的实验材料.
