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pEGFP-survivin对GBC-SD细胞生长的抑制及对化疗敏感性的影响
目的 观察pEGFP-survivin对GBC-SD细胞化疗敏感性的影响.方法 以MTT法检测GBC-SD、GBC-SD/EGFP和GBC-SD/survivin三种细胞的增殖活性;用RT-PCR和Western印迹、检测各组细胞中survivin mRNA和蛋白质水平的表达;以合适浓度的DDP作用相同的时间后,用MTT法检测3种细胞存活率,流式细胞仪测细胞凋亡,并用MTT法筛选IC_(50)值,TUNEL法观察细胞核改变;另外检测DDP作用后各组细胞的caspase-3蛋白酶活性的变化.结果 GBC-SD和GBC-SD/EGFP细胞的增殖活性大致相同,而GBC-SD/survivin细胞的增殖活性则明显下降;RT-PCR和Western印迹均发现GBC-SD/survivin细胞中的survivin表达水平较其余两种细胞明显下降;在给与DDP作用后,GBC-SD/survivin细胞存活率和IC_(50)明显较低,细胞凋亡率较高,而3种细胞用TUNEL法染色后均可见棕色凋亡细胞核.给与DDP作用后,各组细胞caspase-3活性均呈现先升高后下降的趋势,但GBC-SD/survivin细胞中caspase-3的活性明显高于另外两种细胞.结论 pEGFP-survivin表达的survivin shRNA能明显降低GBC-SD细胞中survivin的表达,提高对化疗药物的敏感性.
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凝血酶敏感蛋白-1对胆囊癌细胞凋亡的实验研究
目的 研究凝血酶敏感蛋白-1(TSP-1)对胆囊癌细胞GBC-SD凋亡的体外诱导作用及其可能的作用机制.方法 采用流式细胞术检测TSP-1及其受体CD36,CD47作用后HCCLM3的凋亡率,通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)Caspase-3 mRNA表达的变化.结果 TSP-1组凋亡率(10.56±0.63)%显著高于对照组(3.17±0.33)%和CD47阻断组(4.05±0.27)%(P<0.01).CD36阻断组(8.49±0.37)%高于对照组或CD47阻断组,低于TSP-1组,差异有统计学意义(P<0.01).TSP-1组Caspase3 mRNA的表达TSP-1组(0.575±0.026)和CD36阻断组(0.583±0.023)显著高于对照组(0.336±0.031)和CD47阻断组(0.412±0.017),差异有统计学意义(P<0.01).结论 TSP-1在体外可诱导胆囊癌细胞GBC-SD的凋亡,TSP-1与受体CD47结合后上调Caspase3的表达可能是作用途径之一.
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Survivin shRNA表达质粒的构建、转染和筛选
我们采取基因静寂策略,利用psi RNA-hH1neo载体,以Survivin mRNA为靶序列,构建在细胞内产生短发夹状RNA(shRNA)的重组质粒,观察其对胆囊癌细胞株GBC-SD的抑制作用.
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胆囊癌细胞株GBC-SD类肿瘤干细胞筛选的研究
目的 筛选胆囊癌GBC-SD系中具有干细胞特性的细胞克隆.方法 在肿瘤干细胞培养基加入不同剂量的顺铂悬浮培养GBC-SD,将悬浮细胞收集后注射裸鼠,并持续瘤内注射顺铂,成瘤后取瘤内细胞继续原培养基培养,获得悬浮生长的克隆,分别测定其干细胞标志物(CD133、CD44、CD24)、耐药基因ABCG2细胞株MDR-1和转录因子OCT-4、Nanog的表达.结果 在肿瘤干细胞培养基和顺铂的筛选压力下,GBC-SD细胞能有效形成悬浮生长的克隆球,流式检测结果表明克隆球高表达CD133+(97.6%)、CD44+(77.9%),低表达CD24+(2.3%),同时表达耐药基因ABCG2和MDR-1,定量聚合酶链反应(PCR)及免疫荧光方法检测发现,与普通胆囊癌细胞株GBC-SD比较,克隆球干细胞基因OCT-4、Nanog表达分别增强266、284倍.结论 顺铂结合无血清培养基悬浮培养法筛选GBC-SD,作为一种新的干细胞分选方法,可以分离出具有肿瘤千细胞特征的胆囊癌克隆球.
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靶向miRNA干扰Bmi-1表达对人胆囊癌细胞增殖效应的影响
目的：通过体外RNAi干扰技术靶向抑制原癌基因Bmi-1表达，观察其对胆囊癌细胞增殖的效应及对细胞周期的影响。方法：针对Bmi-1不同位点构建4个miRNABmi-1重组质粒，采用RT-PCR和Western blot检测各组Bmi-1 mRNA和蛋白表达，选择干扰效果明显组质粒转染胆囊癌GBC-SD细胞，48 h后采用BrdU及流式细胞仪检测细胞增殖及细胞周期变化。结果：RT-PCR显示miRNABmi-1重组质粒1、3、4组mRNA表达明显低于对照组（P＜0．05）；Western blot显示miRNABmi-1重组质粒2、3、4组蛋白表达明显低于对照组（P＜0．05）；选取第4组（mRNA及蛋白表达抑制效果强）质粒转染GBC-SD细胞，BrdU显示mRNA-Bmi-1-4组细胞增殖抑制明显，增殖率为46．63±5．31，明显低于对照组（P＜0．05）；细胞周期显示miRNA-Bmi-1-4组G0/G1期细胞增加（72．20±1．71），G2/M和S期细胞减少（18．30±7．21，9．50±6．01），与对照组比较，差异具有显著性（P＜0．05）。结论：靶向沉默Bmi-1表达，能有效抑制胆囊癌细胞增殖，使细胞周期阻滞于G0/G1期，Bmi-1可能成为胆囊癌基因治疗的有效靶点。
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shRNA-Bmi1重组载体构建及其对胆囊癌裸鼠移植瘤hTERT表达的影响
目的 体外构建及鉴定shRNA-Bmi1重组载体,探讨靶向沉默原癌基因Bmi1对人胆囊癌细胞Bmi1mRNA表达、蛋白表达及对裸鼠皮下移植瘤hTERT表达的影响.方法 针对Bmi1不同位点构建4个shRNABmi1重组质粒,采用倒置荧光显微镜观察转染效率,RT-PCR和Western blot检测各组Bmi1mRNA和蛋白表达,选择有效干扰组进行体内实验.构建GBC-SD裸鼠皮下移植瘤模型,随机分为shRNA-Bmi-4组(实验组)、shRNA-Scramble(错配组),Lipofectamine(阴性对照组),GBC-SD(空白对照组).成瘤后进行移植瘤治疗,治疗6周后处死裸鼠,免疫组化检测裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达水平.结果 成功构建了shRNA-Bmi1重组载体.转染胆囊癌48 h后倒置荧光显微镜观察发现shRNA-Bmi1-4组GBC-SD绿色荧光强度增强、转染效率高,RT-PCR及Western blot结果显示shRNA-Bmi1-4组mRNA及蛋白表达量均明显低于各对照组(P＜0.05),对照组间表达量差异无统计学意义(P＞0.05).选取shRNA-Bmi1-4组作为有效干扰序列作后续体内实验.免疫组化检测shRNA-Bmi-4组裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达水平明显低于各对照组(P＜0.05),对照组间蛋白表达量差异无统计学意义(P＞0.05).结论 体外成功构建了shRNA-Bmi1重组载体,顺利进行重组载体的转化和转染实验.靶向沉默Bmi1基因可有效促进胆囊癌细胞Bmi1mRNA降解、抑制其蛋白的表达,同时有效抑制GBC-SD裸鼠移植瘤hTERT蛋白表达.
关键词： shRNA-Bmi1 重组载体 GBC-SD 皮下移植瘤 hTERT
