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Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞的实验研究
目的:探索以Lentivirus为载体,构建同时携带并表达多基因的基因工程人胚神经干细胞(human neural stem cell,hNSC)的可行性,为脊髓损伤治疗的研究提供材料.方法:培养和鉴定hNSC;用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)和神经营养因子-3(neurotrophic factor-3,NT-3)的Lentivirus转染hNSC;用荧光显微镜观察、鼠胚背根神经结培养(dorsal root ganglion,DRG)和Slot blot等方法检测基因工程hNSC的多基因表达情况.结果:培养获得了大量的hNSC;荧光显微镜观察到几乎100%的hNSC表达GFP;基因工程hNSC的培养液能促使大鼠DRG旺盛生长;Slot blot检测到基因工程hNSC能高效分泌NT-3蛋白.结论:以Lentivirus为载体能构建同时携带并稳定表达多基因的基因工程hNSC,为脊髓损伤治疗的基础研究及进一步临床应用提供了有价值的细胞资源.
关键词： Lentivirus 人胚神经干细胞 基因工程 神经营养因子-3 绿色荧光蛋白 -
人胚神经干细胞植入脑出血大鼠的存活和分化状态
背景:研究证实外源性神经干细胞能修复神经,促进脑出血后神经功能障碍的恢复.然而,脑出血后局部内环境对移植神经干细胞存活分化的影响是一个复杂多变的过程.目的:观察人胚神经干细胞植入脑出血大鼠脑内的存活和分化状态.设计、时间及地点:免疫组织化学水平的开放性实验,于2007 05/2008 04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:纳入40只SD雌性大鼠,由中国医学科学院实验动物研究所提供;8周龄流产胚胎大脑由德阳市人民医院医院妇产科提供.方法:取8周龄流产人胚胎大脑皮质细胞,体外培养获得人胚神经干细胞.通过注射自体动脉血到尾状核制作大鼠脑出血模型,出血后2 d将标有5'-溴脱氧尿嘧啶的人胚神经干细胞悬液移植到血肿腔周围的4点,1,2周后处死大鼠,相邻脑组织切片行5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白免疫组织化学双染.主要观察指标:应用免疫组织化学及免疫荧光染色方法观察移植入脑出血大鼠脑内的人胚神经干细胞存活、分化状态和迁徙情况.结果:5'-溴脱氧尿嘧啶阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后1周及2周均可见其存活并向周围迁移,且移植后2周迁移的范围广.移植后1周,脑组织切片见5'-溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2和5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞,且5' -溴脱氧尿嘧啶/微管相关蛋白2双阳性细胞多于5' -溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞.移植后2周,5' -溴脱氧尿嘧啶阳性细胞数明显减少,在脉络丛和微血管中可见,且5'-溴脱氧尿嘧啶/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于5'-溴脱氧尿嘧啶,微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞移植入脑出血大鼠脑内能够存活,移植后逐渐分化为神经细胞和星形胶质细胞.
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人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活和分化
背景:神经干细胞移植可明显改善受损的神经功能,但在体内外多种因素的影响下,移植的神经干细胞其分化数量和分化方向受到限制.目的:观察人胚神经干细胞植入大鼠脑梗死区后的存活、迁移和分化情况.设计、时间及地点:细胞学体内观察,于2007-04/2008-04在泸州医学院附属医院分子生物实验室完成.材料:SD雌性大鼠30只,由中国医学科学院实验动物研究提供.流产胎儿由泸州医学院附属医院妇产科提供.方法:取流产胎儿大脑皮质,剪碎后消化离心,过滤后取沉淀细胞重新悬浮,加入含成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、白血病抑制冈子的DMEM/F12培养基,体外培养获得人胚神经干细胞.30只大鼠通过结扎颈外动脉建立脑梗死模型,行走时向右侧转圈者为成功模型,剔除5只无上述明显症状的失败模型鼠.于造模后24 h,以前囟尾侧0.8 mm,中线右外侧1.2 mm为注射点,每只大鼠移植行BrdU标记的1×109 L-1人胚神经干细胞悬液10 μL,深度为硬脑膜下3.0～3.2 mm.主要观察指标:免疫组织化学及免疫荧光染色观察植入的人胚神经干细胞在脑梗死区的存活、迁移和分化状态.结果:人胚神经干细胞体外培养48 h后聚集成球悬浮生长,传三四代后加入血清诱导可见巢蛋白免疫荧光染色呈阳性,发出绿色荧光并聚集成球.BrdU阳性细胞为椭圆形棕褐色,移植后第2,4 周均可见其在脑梗化区存活片向周围迁移,且第4周时迁移的范围更广.移植后2周,皮质颗粒层和皮质下均见较多的BrdU阳性细胞,目BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞多于BrdU/胶质纤维酸件蛋白双阳性细胞;移植后4周脑梗死区BrdU阳性细胞数明显减少,主要存在于脉络丛和微血管中,且BrdU/胶质纤维酸性蛋白双阳性细胞多于BrdU/微管相关蛋白2双阳性细胞.结论:人胚神经干细胞能存活于脑梗死的环境中,并逐渐分化成神经元或星形胶质细胞.移植后期脑实质内存活的神经干细胞明显减少,大量迁移到侧脑室脉络丛和脑表面微血管内,被内皮吞噬系统消化.
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人胚神经干细胞移植治疗大鼠脑缺血的实验研究
目的研究人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的状况.方法从自然流产的孕10～13周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞.采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1 d后经尾静脉移植未分化的hNSCs入脑缺血大鼠体内,对移植后大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化方法观察移植后hNSCs的存活、迁徙、分化状况.结果从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球,绝大多数的细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestin).hNSCs移植组大鼠自移植后3周末起其NSS显著低于对照组(P＜0.05);移植后2、3、4、5周脑组织切片中均可见5-溴脱氧嘧啶尿苷(Brdu)染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(P＜0.05),移植后3、4、5周末明显多于移植后2周(均P＜0.05);移植组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在Brdu阳性细胞群中,73.8%为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性的星形胶质细胞,16.7%为2,3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)染色阳性的少突胶质细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性的神经元.结论经静脉移植hNSCs能有效改善脑梗死动物的神经功能,hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞.
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人胚神经干细胞及人脐血干细胞治疗大鼠脑缺血的实验研究
目的:观察人胚神经干细胞(hNSCs)、人脐血干细胞(hUCBCs)治疗脑缺血大鼠的效果及其在缺血大鼠脑内的增殖、分化情况.方法:从自然流产的孕10～13周的人胚脑组织中分离、培养hNSCs;采集足月新生儿脐带血60-100 ml,分离出其中的单个核细胞:治疗前hNSCs、hUCBCs均经5-溴脱氧嘧啶尿苷(BrdU)标记48 h.采用线栓法制作大鼠脑缺血模型,1天后经尾静脉注射未分化的hNSCs、hUCBCs至脑缺血大鼠体内.对治疗后大鼠进行神经损害严重程度评分(NSS),用免疫组化方法观察hNSCs、hUCBCs的存活、迁移、分化状况.结果:从人胚脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球;hUCBCs在体外也具有增殖能力.两治疗组大鼠均自治疗后21天起其NSS显著低于对照组(P<0.05),两治疗组间比较各时间点NSS无显著性差异(P>0.05).治疗后14、21、28、35天脑组织切片中均可见BrdU染色阳性细胞,缺血侧明显多于对侧(P<0.05),治疗后21、28、35天明显多于治疗后14天(P<0.05);hNSCs组BrdU染色阳性细胞数多于hUCBCs组(P<0.05);治疗组各时间点脑组织切片中均可见nestin染色阳性细胞;在BrdU阳性细胞群中,hNSCs组73.8%为胶质纤维酸性蛋白(GFAP)染色阳性细胞,16.7%为2.3-环核苷酸磷酸二脂酶(CNPase)染色阳性细胞,9.5%为神经元特异性烯醇化酶(NSE)染色阳性细胞;hUCBCs组74.5%为GFAP染色阳性细胞.15.4%为CNPase染色阳性细胞,10.1%为NSE染色阳性细胞;两组间差异无显著性(P>0.05).结论:hNSCs、hUCBCs均具有多分化潜能,受缺血部位微环境信号的影响分化成3种主要类型的神经细胞;静脉注射hNSCs、hUCBCs能有效改善脑梗死大鼠的神经功能评分;除了hNSCs外,hUCBCs也是治疗缺血性脑血管病的一种可能手段.
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人胚神经干细胞移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎大鼠的实验研究
目的:研究侧脑室注射人胚神经干细胞(hNSCs)移植治疗实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)大鼠的有效性及hNSCs在EAE大鼠脑内的状况.方法:从自然流产的孕9～15周的人胚脑组织中分离、培养神经干细胞.用豚鼠全脊髓匀浆免疫Wistar大鼠制备EAE大鼠模型,分别在免疫后10、15、21天经侧脑室注射移植未分化的hNSCs入大鼠体内,观察hNSCs对EAE动物模型神经功能评分、脑内脱髓鞘病灶数目的影响,免疫组化方法观察移植后的hNSCs在EAE大鼠脑内存活、迁徙、分化的状况.结果:从人胎脑中成功培养出hNSCs,培养条件下呈悬浮状态生长,形成神经球.绝大多数细胞表达神经干细胞的标记物神经巢蛋白(nestjn).hNSCs移植组各时间点大鼠脑组织切片中均可见Brdu、nestin、NSE、GFAP、CNPase染色阳性细胞,CNPase阳性的少突胶质细胞比例随时间的延长而逐渐增多:hNSCs移植组大鼠自免疫后30天起其神经功能评分显著低于对照组(P＜0.05);移植后20、30天脑内脱髓鞘病灶数目明显少于对照组(P＜0.05).结论:hNSCs体内体外均具有多向分化潜能,受炎症部位微环境信号的影响分化成神经元、星型胶质细胞、少突胶质细胞.hNSCs移植能有效改善EAE动物的神经功能评分,减少病灶数目.
关键词： 人胚神经干细胞 移植 实验性自身免疫性脑脊髓炎 -
长期培养人胚神经干细胞对兔脊髓损伤的修复作用
[目的]观察长期培养人胚神经干细胞(hNSCs)的体外生长特性与转染EGFP基因后移植治疗兔脊髓横切损伤模型在体内的生物学活性及对神经结构修复和功能恢复的影响.[方法]体外分离、培养并鉴定hNSCs,用逆转录病毒介导的增强绿色荧光蛋白基因(EGFP)进行转染;制备兔T9全横断脊髓损伤模型;观察hNSCs移植对脊髓损伤后神经结构修复和功能恢复的影响.[结果]从胎龄10～20周的新鲜人胚脑皮层中成功分离出神经干细胞,该细胞具有连续克隆传代能力,诱导分化后表达分化细胞的特异抗原.本实验室已成功连续培养10个月(17代),转染EGFP基因后,仍保持未分化状态,能够自我更新形成新的神经球;移植入兔SCI模型后,hNSCs能在体内存活、迁移、分化并增殖.与对照组相比,hNSCs移植组明显促进了脊髓神经的再生、结构的修复和下肢运动功能的恢复.[结论]hNSCs移植促进了脊髓损伤后神经结构的修复和功能的恢复,是治疗急性脊髓损伤的一种有效方法.
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人胚神经干细胞定向诱导分化为多巴胺能神经元的实验研究
目的建立神经干细胞与骨髓基质细胞的共培养系统,根据该系统的条件性培养液诱导多巴胺能神经元的分化.方法来源于胎脑海马、纹状体、额叶、中脑的神经干细胞与骨髓基质细胞建立起各自的共培养系统,并根据数种条件性培养液诱导神经干细胞的分化,以免疫细胞化学检测神经元的总体分化率及多巴胺能神经元的诱导率.结果骨髓基质细胞及CO-BMSC能显著提高不同来源的神经干细胞的神经元分化率,同时只有中脑神经干细胞能被有效地进行多巴胺能神经元的诱导.结论共培养系统诱发了神经干细胞与骨髓基质细胞的自/旁分泌作用,该作用可根据神经干细胞的区域特异性有效的定向诱导中脑神经干细胞的分化.
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角质细胞生长因子促进人胚神经干细胞增殖与分化的实验研究
目的 探讨人源性角质细胞生长因子2(human keratinocyte growth factor 2,hKGF-2)对体外长期培养人胚神经干细胞(human neural stem cells,hNSCs)存活和分化的影响. 方法 将液氮冻存17代hNSCs复苏常规培养7d形成神经球后,取少许行免疫细胞化学染色鉴定干细胞及分化细胞特异抗原.一部分神经球浓缩后种植至12孔培养板中,分为7组,每组6孔,均添加l mL基础培养液[含N2(1∶100)、20 ng/mL EGF的DMEM/F12培养基]后,B、C、D、E、F组分别添加10、30、60、90、120 ng/mL KGF-2,G组添加10 ng/mL bFGF,A组为空白对照组;培养7、14d观察并计数神经球与hNSCs,了解神经球生长与增殖情况.另一部分浓缩后种植至置有多聚赖氨酸包被玻片的6孔培养板内,分为4组,每组6孔,均添加3 mL DMEM/F12培养基后,A1、B1、C1、D1组对应加入N2(1∶100)、N2(1∶100)+90 ng/mL hKGF-2、FBS(1∶20)、FBS(1∶20)+ 90 ng/mL hKGF-2;培养14 d内观察神经球生长与分化情况.7d时各取5孔玻片行免疫荧光细胞化学鉴定和流式细胞仪检测,分析神经球的生长与分化状况. 结果 复苏后培养形成的神经球含大量巢蛋白阳性细胞,充满整个神经球;诱导分化后表达分化细胞特异性蛋白神经丝200(neurofilament200,NF-200)和胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP).各组神经球培养7d后均有不同程度增大;随hKGF-2浓度增加,神经球数量和hNSCs数目均依次增多,呈递增趋势,E、F、G组显著高于A、B、C、D组(P＜0.05);B、C、D组间两两比较差异亦有统计学意义(P＜0.05);但A、B组间以及E、F、G组间比较差异无统计学意义(P＞ 0.05).体外诱导过程中,A1、B1、C1、D1组分化细胞生长旺盛程度呈递增趋势,组间比较差异均有统计学意义(P＜ 0.05); B1组NF-200阳性率显著高于其余3组(P＜0.05),GFAP阳性率显著低于其余3组(P＜ 0.05); A1、C1、D1组间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).培养14d后各组生长均达峰值,以星形细胞为主. 结论 体外培养17代的hNSCs系纯化hNSCs,hKGF-2能促进其增殖和诱导分化为神经元细胞.
关键词： 人源性角质细胞生长因子2 人胚神经干细胞 增殖 分化
