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大鼠nelin基因干扰质粒的构建及其体外抑制效果研究
目的 构建大鼠nelin基因干扰质粒并对其进行体外抑制效果验证,为研究nelin在心脏发育、心肌肥厚、心衰及其它心脏疾病中的作用提供有效的研究工具.方法 提取大鼠心肌组织RNA,逆转录为cDNA,设计合成含BamH I 和EcoR I酶切位点的引物,以大鼠cDNA为模板PCR扩增获得nelin基因,定向克隆入pEGFP-N1-3FLAG载体,测序验证.以克隆得到的大鼠nelin基因为模板,设计合成候选干扰序列,亚克隆至pGCSIL-U6载体,获得干扰质粒.以nelin基因干扰质粒和重组表达质粒共转染HEK293T细胞,Western Blot方法检测干扰效果.结果 成功克隆了大鼠nelin基因并构建了nelin基因重组表达载体pEGFP-N1-3FLAG-rNelin.设计构建的4个干扰质粒(靶位点分别为+370-388位,+376-394位,+545-563位,+1206-1224,命名为pGCSIL-U6-nelin/site Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ)均可显著降低nelin基因的表达,尤以靶向(+370-388位)位点即pGCSIL-U6/nelin-site I质粒的干扰效果佳.结论 本实验构建的大鼠nelin基因特异性干扰质粒能从蛋白水平上高效特异地抑制nelin基因表达,为进一步开展其功能研究奠定了基础.
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RhoA/SRF信号通路介导Nelin诱导人血管平滑肌细胞表型转化
目的 探讨Nelin基因对人血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)表型转化的调控机制.方法 应用过表达慢病毒载体[Nelin-VSMC]及干扰慢病毒载体[LV-Nelin-SiRNA-VSMC]制备稳定转染的VSMC细胞模型,通过荧光定量PCR以及蛋白质印迹分析(Western blotanalysis,WB)等技术手段,观察Nelin蛋白过表达及表达抑制对人VSMC表型转化的影响及其调控机制.结果 Nelin-VSMC组细胞呈收缩表型,细胞细长,成“谷-峰”样生长,Nelin mRNA、Nelin蛋白和平滑肌分化标志蛋白平滑肌α-肌动蛋白(SMoα-actin)表达显著增加,同时SMα-actin相关调控因子-血清反应因子(SRF)入核转位,RhoA总蛋白表达上调,经Rho激酶特异性抑制剂Y-27632作用后,SRF在细胞核中表达显著减少,同时SMα-actin表达下调;LV-Nelin-SiRNA-VSMC组细胞呈合成表型,细胞体积变大,细胞极性消失,生长状态无序,Nelin mRNA、Nelin蛋白和SMα-actin蛋白表达显著降低,同时伴有SRF出核转位及RhoA总蛋白表达下调.结论 在体外培养的人VSMC中,Nelin依次激活SMα-actin蛋白相关调控因子RhoA和SRF引起SMα-actin表达增加,促进VSMC向收缩表型转换.
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人细胞骨架调节蛋白基因Nelin的原核表达与分离纯化
目的:原核表达并分离纯化人细胞骨架调节蛋白基因Nelin.方法:利用DNAstar软件预测Nelin的B细胞表位,选择Nelin基因B细胞表位较多、特异性强的片段.用DNA重组技术,将此片段插入原核表达载体pET28a(+),构建C末端带有His6标签的原核表达载体pET28a-Nelin,转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导,产物用Ni2+金属螯合吸附层析柱纯化.结果:成功构建了pET28a-Nelin表达载体,IPTG诱导后表达分子量约为17 000的可溶性蛋白,Nelin-His6蛋白的表达量占菌体总蛋白的18%,经Ni2+金属螯合层析柱纯化,得到了电泳纯的Nelin-His6蛋白.结论:建立了稳定的Nelin基因的表达体系,为其功能研究奠定了基础.
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应用酵母双杂交系统筛选与新基因nelin相互作用的蛋白质
目的通过筛选能够与新基因nelin的心肌特异表达产物相互作用的蛋白质从而揭示nelin的生物功能.方法构建表达nelin阅读框全长的诱饵质粒并利用酵母双杂交系统筛选人心脏cDNA文库,以寻找与nelin蛋白发生相互作用的蛋白质.并利用生物信息学方法对筛选得到的蛋白质进行功能结构域分析.结果筛选得到3个蛋白质分别为肌联蛋白(Titin )N2B亚型, 细丝蛋白(Filamin )C亚型即γ-Filamin和α胰蛋白酶抑制物重链前体(inter-alpha trypsin inhibitor heavy chain precursor,ITIH).对这3种蛋白的C末端结构域进行分析发现Titin和Filamin均含有免疫球蛋白样结构域(Ig-like domain).结论实验结果揭示了新基因nelin很可能表达一个细胞骨架相关蛋白,它可通过其蛋白质的C末端同Titin和Filamin的免疫球蛋白样结构域发生相互作用而参与细胞骨架网络的形成.
