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99mTc-Annexin B1的制备及其探测细胞凋亡的实验研究
目的 制备99mTc-Annexin B1并对其体外、体内生物分布以及探测体内细胞凋亡的潜力进行评价.方法 应用99mTc直接标记蛋白质的方法制备99mTc-Annexin B1.采用与活化人血小板结合实验检测99mTc-Annexin B1的体外生物活性.在正常小鼠体内进行生物分布研究.采用地塞米松诱导小鼠胸腺凋亡的动物模型和anti-Fas单抗诱导小鼠肝脏凋亡的动物模型检测99mTc-Annexin B1探测体内细胞凋亡的潜力,并用TUNEL染色证实细胞凋亡.结果 直接标记法制备的99mTc-Annexin B1具有很高的放射化学纯度和很好体外稳定性.与活化人血小板的结合实验表明,99mTc-Annexin B1具有与PS结合的体外生物活性.99mTc-Annexin B1在体内具有较快的清除特性,主要聚集于肾脏.地塞米松诱导18 h后,小鼠胸腺对99mTc-Annexin B1的摄取显著高于对照小鼠胸腺的摄取.Anti-Fas诱导后2 h时后,小鼠肝脏对99mTc-AnnexinB1的摄取显著高于为对照动物的肝脏摄取.结论 99mTc-Annexin B1具有与PS结合的体外生物活性和探测体内细胞凋亡的潜力,是一种新的细胞凋亡显像剂.
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18F-SFB-Annexin B1探测化疗后肿瘤细胞凋亡的实验研究
背景与目的：诱导细胞凋亡是肿瘤化疗的机制之一，分子影像能在活体内无创、动态地检测细胞凋亡，有助于药物筛选和疗效分析。本研究旨在探讨N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯偶联的氟-18-膜联蛋白B1(18F-SFB-AnnexinB1)显像剂早期评价化疗诱导细胞凋亡的可行性。方法：以SFB作为中间体将18F标记到AnnexinB1上。了解18F-SFB-Annexin B1在健康小鼠体内的生物分布特性。建立Walker-256荷瘤小鼠模型，随机分为两组，化疗组腹腔注射环磷酰胺(CTX 200 mg/kg，n=3)，对照组注射等体积无菌0.9%的氯化钠溶液(n=3)。24 h后静脉注射18F-SFB-Annexin B1，分别于注射后1、2、3、4 h进行PET/CT显像。比较肿瘤/肌肉放射性摄取率比值(T/M)与原位缺口末端标记(TUNEL)染色法测定凋亡指数(AI)的关系。结果：18F-SFB-Annexin B1放化纯度>95%，生物分布显示肾脏放射性高，其次为肝、脾和心肌，显像剂在体内清除速率快。化疗组与对照组各时间点T/M比值分别为4.38±0.56、6.75±1.16、6.44±1.12、4.81±0.17和2.35±0.14、2.99±0.55、3.04±0.41、2.33±0.47，差异有统计学意义(F分别为23.790、16.913、14.046、77.517，P均<0.05)。TUNEL染色AI分别为(21.00±0.04)%和(8.58±0.01)%，差异有统计学意义(F=21.539，P<0.05)，且T/M值与AI间有很好的相关性(r=0.91，P<0.05)。结论：18F-SFB-AnnexinB1能早期反映化疗诱导的细胞凋亡，有望用于活体细胞凋亡分子显像和早期疗效判断。
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融合蛋白AnxB1-MLT的表达、纯化及其对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖的抑制作用
目的 以膜联蛋白B1(AnxB1)为导向分子,与蜂毒素(MLT)基因融合,制备AnxB1-MLT融合蛋白,探讨其对磷脂酰丝氨酸脂质体的结合活性及对肝癌细胞SMMC7721和HepG2增殖的抑制作用.方法 利用重叠延伸PCR技术构建AnxB1和MLT的融合基因AnxB1 MLT,克隆至原核表达载体pGEX-5T,转化至宿主菌K802,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导AnxB1-MLT融合蛋白表达,优化表达条件,用谷胱甘肽S-转移酶(GST)亲和色谱纯化柱纯化融合蛋白.采用磷脂结合实验验证AnxB1-MLT融合蛋白的钙依赖性磷脂结合活性,采用CCK 8方法分别检测AnxB1-MLT融合蛋白对肝癌细胞系SMMC7721和HepG2细胞增殖的影响.结果 AnxB1-MLT融合蛋白在宿主菌K802中能够表达,在菌液生长至D600为0.6时,加入诱导剂IPTG至终浓度0.2 mmol/L,低温(22～24℃)诱导表达4h,可使蛋白表达量较高且在上清有表达.通过GST亲和色谱纯化柱纯化融合蛋白,SDS-PAGE结果显示在63 000处可见单一目的条带,纯度＞95％.AnxB1-MLT融合蛋白保留了AnxB1的钙依赖性磷脂结合活性,并能显著抑制肝癌细胞系SMMC7721和HepG2的增殖.结论 成功制备了AnxB1-MLT融合蛋白,该融合蛋白具有AnxB1的钙依赖性磷脂结合活性,可抑制肝癌细胞SMMC7721和HepG2的增殖,为进一步利用动物实验研究AnxB1-MLT的抗肿瘤效果奠定了基础.
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Annexin B1单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立和特性鉴定
目的:制备抗Annexin B1单克隆抗体,为进一步研究Annexin B1的生理功能奠定基础. 方法:制备了具有抗原性的Annexin B1,并采用脾内包埋法免疫小鼠,无菌取出脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,随后以ELISA方法和有限稀释法进行3 次筛选和亚克隆.结果:用杂交瘤技术,我们获得了1株杂交瘤细胞株,能稳定地分泌高滴度的针对Annexin B1的特异单抗.结论:成功筛选并制备了Annexin B1的特异单抗,为下一步功能研究打下了良好的基础.
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18F-SFB-Annexin B1探测细胞凋亡实验研究
目的 在体外及体内评价自动化合成模块合成的18F-N-琥珀酰亚胺-4-氟苯甲酸酯(SFB)-膜联蛋白(Annexin)B1探测细胞凋亡.方法 使用anti-Fas抗体诱导Jurkat细胞发生凋亡,用流式细胞仪检测细胞凋亡存在.通过暂时性阻断家兔肾动脉(45 min)使单侧肾经缺血再灌注发生细胞凋亡,24 h后静脉注射18F-SFB-Annexin B1,分别于注射后10,30,60,90,120和240 min行PET/CT显像.采用原位末端标记法(TUNEL)和HE染色法证实肾存在细胞凋亡.结果 用antiFas抗体诱导后细胞调亡率实验组为25.98%(120 min),对照组仅为1.81%;实验组细胞对18F-SFBAnnexin B1的摄取高于对照组,在注射18F-SFB-Annexin B1后240 min PET/CT图像上,处理侧肾的放射性摄取高于正常对照肾.TUNEL和HE染色法证实处理侧肾存在大量细胞凋亡.结论 18F-SFB-Annexin B1保留了同磷脂酰丝氨酸(PS)结合的生物活性,在体外及体内探测细胞凋亡方面具有应用潜力.
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99Tcm-联肼尼克酰胺-膜联蛋白B1的制备及其探测细胞凋亡的生物学评价
目的 制备99Tcm-联肼尼克酰胺(HYNIC)-膜联蛋白(Annexin)B1并对其探测细胞凋亡的潜力进行生物学评价.方法 应用99Tcm间接标记蛋白质的方法,以HYNIC作为双功能螯合剂制备99Tcm-HYNIC-Annexin B1.采用与活化人血小板结合实验检测99Tcm-HYNIC-Annexin B1的体外生物活性.采用地塞米松诱导小鼠胸腺凋亡的动物模型和anti-Fas单克隆抗体诱导小鼠肝凋亡的动物模型(均设相应对照组),检测99Tcm-HYNIC-Annexin B1探测体内细胞凋亡的潜力,并用原位末端标记法(TUNEL)染色证实细胞凋亡.采用配对t检验进行统计学处理.结果 间接标记法制备的99Tcm-HYNIC-Annexin B1具有很高的放化纯(＞96%)和较好的体外稳定性.与活化人血小板的结合实验表明,99Tcm-HYNIC-Annexin B1具有与磷脂酰丝氨酸(PS)残基结合的生物活性.地塞米松诱导18 h后,小鼠胸腺对99Tcm-HYNIC-Annexin B1的摄取为对照组的3.50倍(t=5.234,P＜0.01).anti-Fas诱导后2 h时,小鼠肝对99Tcm-HYNIC-Annexin B1的摄取为对照组的2.02倍(t=6.178,P＜0.01).结论 采用99Tcm间接标记法制备的99Tcm-HYNIC-Annexin B1具有很高的放化纯及较好的体外稳定性.99Tcm-HYNIC-Annexin B1具有与PS结合的体外生物活性和探测体内细胞凋亡的潜力,是一种新的细胞凋亡显像剂.
