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fgl2凝血酶原酶多肽抗体的制备和应用
目的利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源fgl2凝血酶原酶(hfgl2、mfgl2)的特异性多克隆抗体,以期用于与fgl2表达异常密切相关的疾病的研究和诊治.方法根据mfgl2、hfgl2基因编码的氨基酸序列合成多肽3(Pep3)和多肽4(Pep4),并用化学方法与匙孔血蓝蛋白(KLH)连接,纯品Pep3-KLH和Pep4-KLH免疫动物,所制备的抗血清用ELISA、Western blot和前凝血质活性(PCA)实验鉴定,并采用免疫组化法应用于乙型肝炎患者肝组织中hfgl2的检测.结果 ELISA检测表明,所制备的抗血清可分别与Pep3和Pep4发生特异性免疫反应;Western blot结果显示,抗血清可识别MHV-3感染BALB/cJ小鼠腹腔巨噬细胞特异性条带,相对分子质量(Mr)为65×103;PCA实验提示,抗血清具有中和mfgl2分子酶活性的作用.对病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hfgl2仅在重型乙型肝炎患者高表达,而在慢性乙型肝炎和肝硬化患者的肝组织中无表达.结论所制备的fgl2的多肽抗体(多克隆抗体)可识别mfgl2和hfgl2分子,具有与抗原特异性结合、中和其酶活性的特征,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段.
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MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型中γδT细胞的活化性受体表达
目的 探讨暴发性肝炎初期疾病急速恶化的机制,探讨在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠爆发性肝炎模型中,小鼠感染病毒前后γδT细胞其活化受体NKG2D表达情况.方法 建立MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型,在不同感染时间点0、24、48 h时对小鼠肝组织行苏木精-伊红染色(HE染色),观察肝脏病理学改变,并检测血清谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)水平.采用流式细胞学方法标记γδT细胞,并标记其NKG2D的表达.结果 MHV-3诱导小鼠暴发性肝炎模型中,γδT表面所表达活化性受体NKG2D表达增高.结论 小鼠暴发性肝炎初期,肝脏重要的天然免疫效应细胞γδT细胞表面活化性受体NKG2D表达增高.
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TLR4对MHV-3诱导的C3H/He小鼠病毒性肝炎转归的影响
目的：探讨TLR4对3型鼠肝炎病毒（MHV-3）诱导的C3H/He小鼠肝炎转归的影响。方法观察C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠感染MHV-3后的临床症状（皮毛异常、呼吸加快及身体颤抖）并进行评分。记录两亚系小鼠的存活情况并进行比较。所有小鼠观察至感染后40d。结果小鼠品系对临床症状评分不起作用（P=0.718）。临床评分有随时间变化的趋势（P＜0.001），且时间因素的作用随小鼠品系而不同（P=0.004）。C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠临床症状评分仅在感染后第5、6、13天出现差异：（13.071±1.184）和（10.933±4.608）（P＜0.001），（8.321±5.048）和（11.304±3.901）（P＜0.001），（13.091±1.578）和（10.846±3.671）（P=0.015）。C3H/HeJ及C3H/HeN小鼠存活率分别为26.7％和23.3％，平均存活时间分别为16.267d和16.433d，无显著差异（P=0.922）。结论 MHV-3诱导的C3H/He小鼠病毒性肝炎转归不依赖于TLR4。
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KCTD9多肽抗体的制备和应用
目的:利用人工合成多肽制备针对人源、鼠源KCTD9(hKCTD9、mKCID9)的特异性多克隆抗体,以期用于与KCTD9表达异常密切相关疾病的研究和诊治.方法:根据hKCTD9、mKCTD9基因编码的氨基酸序列合成多肽(Pep),并用化学方法与匙孔血蓝蛋白(KLH)连接,纯品Pep-KLH免疫纯种新西兰雄性大白兔,所制备的抗血清用ELISA、Western blot实验鉴定,并采用免疫组化法应用于正常人和乙型肝炎患者肝组织中hKCTD9的检测.结果:ELISA检测表明,用Pep-KLH免疫的大白兔所制备的抗血清可与Pep发生特异性免疫反应;Western blot结果显示,抗血清可识别MHV-3感染BALB/cJ小鼠PBMC特异性条带,相对分子质量(Mr)为37 KD.对正常人和病毒性乙型肝炎患者肝组织免疫组织化学染色发现hKCTD9在正常人和重型乙型肝炎患者均有表达,但是在重型乙型肝炎患者高表达.结论:所制备的KCTD9的多肽抗体(多克隆抗体)可识别mKCTD9和hKCTD9分子,具有与抗原特异性结合,为深入研究这一新发现的分子提供了有力的科学手段.
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双阴性T细胞活化自然杀伤细胞促进小鼠暴发型肝炎的发生发展
目的 检测双阴性T(double negative T,DNT)细胞对自然杀伤(natural killer,NK)细胞功能的影响,初步探讨其在3型鼠肝炎病毒(murine hepatitis virus strain 3,MHV-3)诱导的小鼠暴发型肝炎(fulminant viral hepatitis,FVH)模型中发挥的作用.方法 通过腹腔注射MHV-3感染BALB/cJ小鼠诱导FVH,尾静脉转移过继FVH小鼠脾脏DNT细胞,观察小鼠生存时间和肝脏组织病理学改变,流式细胞术检测小鼠肝脏NK细胞CD69表达情况.磁珠分选肝脏DNT细胞和NK细胞,共培养24 h后,检测NK细胞CD69、胞内干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的表达水平,利用乳酸脱氢酶释放实验检测NK细胞对原代肝细胞的杀伤作用.结果 转移过继DNT细胞,FVH小鼠生存时间缩短,在三天内全部死亡.转移过继组小鼠肝脏NK细胞CD69表达比例较对照组显著升高[(80.60±5.56)％比(4.53±4.82)％,P<0.05].肝脏DNT细胞和NK细胞以10:1比例共培养,NK细胞CD69表达比例较NK单独培养显著增加[(23.1±3.7)％比(4.53±4.82)％,P<0.05],TNF-α表达水平升高[(8.9±2.3)％比(3.0±0.2)％,P<0.05],NK细胞对原代肝细胞的杀伤活性明显增强[(7.6±0.5)％比(3.7±0.4)％,P<0.05].结论 DNT细胞可促进NK细胞活化和TNF-α表达,增强NK细胞对肝细胞的杀伤作用,可能为DNT细胞参与FVH发生发展的机制之一.
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调节性T细胞在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠暴发型肝炎模型中作用的初步探讨
目的 检测调节性T细胞(Tr)在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠暴发型肝炎模型中的比例变化及细胞因子表达,初步探讨Tr在该疾病模型中的作用.方法 通过腹腔注射MHV-3感染BALB/cJ小鼠诱导暴发型肝炎,观察小鼠的生存时间,检测血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)水平,利用苏木精-伊红(HE)染色法检测肝脏病理学改变,分离感染不同时间点外周血、脾脏以及肝脏中的淋巴细胞,利用流式细胞术来检测Tr的比例以及细胞因子IL-10表达水平.结果 BALB/cJ小鼠感染MHV-3后,全部在3～6d内死亡,血清ALT、AST水平随着感染时间延长逐渐升高,HE染色显示肝脏组织炎症及坏死程度逐渐加重,流式细胞术检测发现随着感染时间延长,小鼠肝脏中的Tr的比例明显升高.同时肝脏Tr分泌细胞因子1L-10的比例以及肝脏组织IL-10的mRNA水平逐渐升高.结论 MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中Tr在肝脏中的比例和功能显著升高,这种代偿性升高提示Tr可能发挥调节机体过度免疫反应的功能.
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双黄连对MHV-3诱导的暴发型肝衰竭小鼠的保护作用研究
目的 探讨双黄连对病毒感染诱导的暴发性肝衰竭小鼠的保护作用.方法 取BABL/cJ小鼠36只,随机均分为对照组、模型组和双黄连处理组.取滴度为1×106 PFU/ml的3型鼠肝炎病毒(MHV-3),采用高压水注射法经小鼠尾静脉注入小鼠体内,诱导暴发性肝衰竭模型.在造模后给予10％双黄连或生理盐水灌胃治疗7 d.采用RT-PCR法检测小鼠肝组织IP-10 mRNA和血清MHV-3 DNA水平,并检测血清转化生长因子-βl(TGF-βl)、白细胞介素-10(IL-10)、层黏连蛋白(LN)、透明质酸(HA)和肝功能指标.结果 在治疗7 d,模型组和双黄连组小鼠血清谷丙转氨酶(ALT)分别为(229.03±30.56)IU/L和(22.83±6.02)IU/L,谷草转氨酶(AST)为(139.01±11.75)IU/L和(32.45±4.59)IU/L,LN分别为(99.86±10.57)nmol/L和(57.02±7.24)nmol/L,HA为117.05±16.72)nmol/L和(53.01±11.35)nmol/L,TGF-βl分别为(319.46±39.12)pg/ml和(93.87±11.20)pg/ml,IL-10为25.70±3.87)pg/ml和(1.07±0.09)pg/ml,MHV-3 DNA分别为12.47±3.05)lg copies/mL和(1.24±0.10)lg copies/mL,肝组织IP-10 mRNA分别为[(25.70±3.87)和(12.79±3.08),P<0.05].结论 双黄连有一定的抗MHV-3作用,可能是通过抑制肝内IP-10 mRNA水平,减少IL-10对肝细胞的炎性损伤,阻止了肝组织纤维化而促进了肝功能的恢复.
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CXCR3阳性自然杀伤细胞在MHV-3诱导暴发性肝炎小鼠组织分布动态变化
目的 检测CXC趋化因子受体3(CXCR3)阳性自然杀伤(NK)细胞在3型鼠肝炎病毒诱导的暴发性肝炎小鼠肝脏、脾脏、骨髓及外周血中百分比的动态变化.方法 腹腔注射3型鼠肝炎病毒诱导BALB/cJ小鼠暴发性肝炎,利用流式细胞术检测小鼠肝脏、骨髓、外周血及脾脏CXCR3阳性NK细胞百分比的变化.结果 肝脏CXCR3阳性NK细胞百分比在感染后12小时(20.47±1.54％)和24小时(31.53±2.53％)较感染前(14.0±0.25％)均显著升高(P均＜0.05),至感染48小时下降至感染前水平；骨髓CXCR3阳性NK细胞百分比随感染时间延长而逐渐减少,由初始水平(25.53±3.50％)的高点至72小时时降至较低水平(1.2±0.17％,P＜0.05)；脾脏CXCR3阳性NK细胞的百分比在感染后12小时增高(13.63±3.167％),随后下降,至72小时达到较低水平(2.20±0.53％,P＜0.05)；外周血CXCR3阳性NK细胞的百分比在24小时增高,在72小时下降至感染前水平.结论 在MHV-3感染后,CXCR3阳性NK细胞可能逐渐迁移至肝脏,从而在小鼠暴发性肝炎发生发展中发挥重要作用.
关键词： 暴发性肝炎 3型鼠肝炎病毒 CXC趋化因子受体3 自然杀伤细胞 -
TCRγδ+CD3+CD4-CD8-双阴性T细胞在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠慢性病毒性肝炎发病中的作用
目的 本研究拟探讨在MHV-3诱导的慢性病毒性肝炎模型小鼠外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞在T淋巴细胞中比例变化以及其主要表面分子标记的变化.方法 取60只C3H/Hej小鼠,腹腔注射10pfu MHV-3;应用流式细胞仪三色或四色荧光分析法分别检测小鼠外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞在T淋巴细胞中的比例及其CD25、CD28、CD30和CD44表达的变化.结果 MHV-3诱导的慢性病毒性肝炎小鼠各时间点外周血和脾脏TCRγδ+DNT在T淋巴细胞中的比例较对照组显著升高(P<0.05);在感染后10天达到高峰:外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞占T淋巴细胞的比例分别为4.8±1.5%和4.5±1.3%;模型小鼠外周血和脾脏TCRγδ+DNT细胞的表型均为TCRγδ+CD3+CD4-CD8-CD25-CD28-CD30-CD44+.结论 感染MHV-3后C3H/Hej小鼠体内TCRγδ+DNT细胞的数量增加,提示TCRγδ+DNT细胞参与了MHV-3诱导的小鼠慢性病毒性肝炎的发生和发展过程.
关键词： 病毒性肝炎 3型鼠肝炎病毒 TCRγδ+DNT细胞 小鼠 -
CD4-CD8-T细胞对小鼠病毒性肝炎慢性化的免疫调节作用
目的:探讨CD4-CD8-T细胞(DNT细胞)在小鼠病毒性肝炎慢性化中的作用和机制.方法:C3H/Hej小鼠感染3型鼠肝炎病毒(MHV-3)建立了小鼠慢性肝炎模型.分离感染病毒5天后的小鼠脾脏细胞,利用磁珠法分选得到DNT细胞,通过小鼠尾静脉注射过继到同样感染MHV-3的小鼠,观察其生存率、组织炎症和病毒载量的变化,检测FasL表达情况.体外将DNT细胞与同来源的CD8+T淋巴细胞共培养观察其抑制效应.结果:实验发现,肝炎小鼠的生存率由23.3％提高到46.67％,肝脏组织炎症减轻,病毒载量无变化.体外实验DNT细胞高表达FasL,对CD8+细胞有特异性杀伤效应.结论:CD4-CD8-双阴性T细胞可以通过Fas/FasL途径对CD8+T细胞进行特异性杀伤,从而导致肝炎的慢性迁延.
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γδT细胞在3型鼠肝炎病毒诱导的小鼠慢性病毒性肝炎中作用的探讨
目的:探讨在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的鼠慢性病毒性肝炎模型中随着感染时间的延长肝脏γδT细胞在肝脏T细胞中的比例变化以及细胞因子IFN(干扰素)-γ的表达.方法:C3H/Hej小鼠腹腔注射10pfu(空斑形成单位)MHV-3建立小鼠慢性病毒性肝炎模型,应用流式细胞技术荧光分析法检测MHV-3感染后0天、5天、10天、15天、20天肝脏中γδT细胞在T细胞中的比例变化及其表达IFN-γ的比例.结果:随着MHV-3感染时间的延长,模型中肝脏γδT细胞在肝脏T细胞中的比例较0天逐渐升高(P＜0.05),在感染后10天达到高值.肝脏γδT细胞大量表达IFN-γ,在MHV-3感染10天后达到高值.结论:感染MHV-3后C3H/Hej小鼠体内γδT细胞的数量增加并表达IFN-γ,提示γδT细胞参与了MHV-3诱导的小鼠慢性病毒性肝炎的发生发展过程.
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T细胞抗原受体γδ+T细胞在小鼠暴发型肝炎模型中的作用
目的:T细胞抗原受体(TCR)γδ+T细胞是一种表型和功能独特的T淋巴细胞亚群.通过检测TCR γδ+T细胞在3型鼠肝炎病毒(MHV-3)诱导的小鼠暴发型肝炎模型中的比例变化,初步探讨TCRγδ+T细胞在该疾病模型中的作用.方法:通过腹腔注射MHV-3感染BALB/cJ小鼠诱导暴发型肝炎,利用流式细胞术来检测小鼠外周血、肝脏及脾脏TCRγδ+T细胞的比例变化,并进行统计学分析.结果:BALB/cJ小鼠感染MHV-3后,全部在3～6天内死亡,小鼠外周血、脾脏及肝脏中的TCR γδ+T细胞占CD3+T细胞的比例均在感染后48小时发生显著升高(P＜0.05).MHV-3诱导的小鼠暴发型肝炎模型中TCR γδ+T细胞的比例显著升高,与疾病严重程度呈正相关.结论:TCR γδ+T细胞可能在小鼠暴发型肝炎发生发展中发挥重要作用,为进一步研究小鼠暴发型肝炎的发病机制提供更充分的理论基础.
