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人巨细胞病毒PP150蛋白C端多肽与gp52蛋白片段的融合表达
目的将人巨细胞病毒PP150蛋白C端多肽与gp52蛋白片段融合, 构建表达该融合蛋白的工程菌. 方法合成PP150蛋白C端25个氨基酸的基因片段,并选用细菌偏爱的密码子.用PCR方法扩增gp52蛋白基因片段.将这2个基因片段分别克隆至同一质粒pET28a(+)内的NcoⅠ/BamHⅠ和BamHⅠ/EcoRⅠ位点,使两者串联在一起, 并且翻译框架一致,可表达1个融合蛋白.将重组质粒转化大肠杆菌,用酶切及SDS-PAGE等方法筛选表达融合蛋白的工程菌. 结果构建成功了高效表达PP150 C端多肽与gp52蛋白片段的融合蛋白工程菌,表达量为35%左右.初步纯化获得了表达的融合蛋白. 结论初步纯化的融合蛋白能与已知的抗gp52-IgM阳性血清和抗PP150-IgM阳性血清反应,说明融合蛋白C端的gp52蛋白保持较好的抗原性,融合蛋白N端的PP150 C端多肽也显示有抗原性.
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HCMV gp52基因的克隆与表达
目的:克隆表达人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)gp52基因,制备特异性抗原,用于HCMV早期诊断.方法:从感染的HCMV细胞上清液中提取病毒的DNA, 用PCR扩增gp52蛋白IgM抗原决定簇编码区DNA片段,并将其克隆到pGEM-Teasy载体测序,然后将其克隆到含有谷胱甘肽转移酶(GST)融合蛋白表达载体pGEX-5X-3中表达,表达产物经GST亲和层析柱纯化后,采用ELISA和免疫印迹(Western blotting)检测重组蛋白的抗原性.结果:经序列测定gp52基因片段的序列正确,并在pGEX-5X-3表达载体中得到了高效表达.表达的融合蛋白用亲和层析柱纯化后经免疫印迹和ELISA分析具有良好的抗原性,能够与HCMV IgM阳性血清呈特异性反应.结论:通过基因工程制备的重组gp52蛋白可作为抗原用于HCMV感染者的早期诊断.
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人巨细胞病毒gp52蛋白基因片段的克隆及表达
目的为获得高表达人巨细胞病毒gp52蛋白基因的工程菌.方法通过计算机分析,筛选出巨细胞病毒蛋白gp52中优势抗原决定簇,用PCR技术扩增克隆了含强抗原决定簇的基因片段.将克隆的基因片段插入表达载体pET28(a)内,转化大肠杆菌BL21,经Sepharery1 S-200分子筛及Ni-NTA Sepharose螯合层析进行纯化.结果获得的工程菌所表达的gp52蛋白片段相对分子质量约为21 000,约占菌体可溶性蛋白的28%.获得的表达蛋白纯度达95%,电泳显示单一条蛋白带,ELISA分析证实有较强的抗原性和较好的特异性.结论本研究对人巨细胞病毒感染,尤其是对孕妇及献血员等感染的检测有重要意义.
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重组人巨细胞病毒gp52蛋白的纯化及鉴定
目的对大肠杆菌表达的人巨细胞病毒gp52蛋白纯化及鉴定.方法将表达gp52蛋白的菌体超声裂解后,离心取上清,经DEAE-Sapharose FF阴离子柱纯化,收集纯化的gp52蛋白,再上S-Sepharose FF阳离子柱纯化,收集纯化的gp52蛋白,经SDS-PAGE检测其纯度,用Westem blot和ELISA检测其抗原性.结果纯化的gp52蛋白纯度达95%以上,并有较好的抗原性和特异性.结论制备的重组gp52蛋白可用于人巨细胞病毒抗体的检测等研究.
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抗重组人巨细胞病毒单克隆抗体的制备与鉴定
为了获得抗人巨细胞病毒(HCMV)单克隆抗体(McAb).采用重组HCMV(rhCMV)gp52蛋白片段免疫Balb/c小鼠,将免疫鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合,经ELISA法筛选阳性克隆及测定效价,用免疫印迹法进行特异性鉴定.终获得4株(3E9,5A6,4G12,2H2)能稳定分泌高效价抗rhCMV McAb的杂交瘤细胞.其培养上清的ELISA效价分别为:1:2048,1:1024,1:1024,1:512;腹水效价分别为:1×10-7,1×10-7,1×10-6,2×10-6.它们分别识别gp52蛋白上的2个不同的抗原表位,2H2识别gp52蛋白上的一个表位,3e9,5A6和4G12识别另一个表位.该单抗可作为快速诊断CMV感染的特异性抗体.
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巨细胞病毒gp52蛋白原核可溶性表达与应用
目的 生物工程方法在原核系统内可溶性表达巨细胞病毒gp52蛋白并进行纯化,获得可以用于检测巨细胞病毒特异性抗体的重组抗原. 方法 利用PCR扩增获得巨细胞病毒gp52核酸序列,然后克隆至pET-DsbC核融合表达载体中,在原核系统进行诱导表达并纯化,用Western blot和ELISA检测其抗原性及实用性. 结果 表达纯化的Ds-bC-gp52融合蛋白分别经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份抗巨细胞病毒IgM阳性血清和60份阴性血清.其中用酶标记DsbC-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率达96.6％,阴性检出率100％. 结论 融合蛋白DsbC-gp52在大肠杆菌中主要以可溶性表达形式存在,获得的高纯度融合蛋白抗原性和特异性强,利用其建立的IgM捕获ELISA方法,可用于临床检测风疹病毒的早期感染.
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人巨细胞病毒pp150-gp52蛋白原核可溶性表达与IgM捕获ELISA方法建立和应用
目的 原核系统内表达并纯化巨细胞病毒pp150-gp52融合蛋白优势抗原表位,建立IgM捕获ELISA方法并应用.方法 通过重叠PCR技术扩增获得巨细胞病毒pp150-gp52优势片段核酸序列,在原核系统内可溶性表达DsbCpp150-gp52融合蛋白并纯化,用Western blot和ELISA检测融合蛋白的特异性和应用价值.结果 纯化获得的融合蛋白DsbC-pp150-gp52经酶标记建立IgM捕获ELISA方法,检测60份临床阳性血清和60份健康人血清.其中以酶标记DsbC-pp150-gp52蛋白建立的捕获ELISA法阳性检出率96.7％,阴性检出率100％,初步验证DsbC-pp150-gp52融合肽具有非常好的抗原特异性.结论 融合蛋白DsbC-pp150-gp52在大肠埃希菌中以可溶性表达形式存在,获得的高纯度重组融合蛋白具有抗原性和特异性强的特点,采用IgM捕获ELISA的实验方法,可开发检测试剂盒用于风疹病毒的早期检测.
