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两种人羊膜细胞的表型鉴定和分化潜能测定
本研究旨在分离、培养和表型鉴定两种人羊膜细胞并分析其多向分化潜能.羊膜中可分离出来源于外胚层的羊膜上皮细胞和来源于中胚层的羊膜间充质细胞.用流式细胞术和免疫荧光法对其进行表型鉴定,同时用免疫荧光法分析其多向分化潜能.结果表明:两种人羊膜细胞阳性表达HLA-A,B,C和间充质干细胞的标志( CD29,CD73,CD44,CD59,CD90,CD105,CH166),不表达造血干细胞的标志(CD31,CD34,CD45,HLA-DR),弱表达协同刺激分子( CD40,CD40L,CD80,CD86),且这些表型的表达量在第3-7代都维持稳定.免疫荧光法显示羊膜上皮细胞表达角蛋白19,不表达波形蛋白,而羊膜间充质细胞则相反.对其多向分化潜能测定显示,羊膜间充质细胞更好地向心肌细胞分化,而羊膜上皮细胞更好地向神经细胞分化.结论:从羊膜中可分离出羊膜上皮细胞和羊膜间充质细胞,两种细胞的表型相似,多向分化潜能却不同.羊膜上皮细胞具有更好的外胚层分化潜能,而羊膜间充质细胞更好地向中胚层分化.此结论对细胞治疗有很好的指导作用.
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HLA-G参与羊膜间充质干细胞抑制淋巴细胞增殖的机制研究
本研究旨在探讨羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,HAMSC)抑制淋巴细胞增殖的作用机制,证明人类白细胞抗原G(HLA-G)参与了HAMC的免疫抑制功能.从胎膜上分离、培养和扩增HAM-SC,用流式细胞术进行表型鉴定,同时检测膜表面和胞质中HLA-G的含量;用ELISA法检测培养上清中HLA-G的含量;MTT法检测混合培养后HAMSC对淋巴细胞增殖的影响.结果表明,HAMSC膜表面和胞质均表达HLA-G,膜表面和胞质HLA-G的含量分别是(16.75±3.871)％和(39.14 ±4.274)％,在细胞培养上清中的含量是5.2ng/ml.HAMSC及其上清加入淋巴细胞混合培养后,淋巴细胞抑制率增高,当HLA-G特异性抗体加入后这种抑制效应减低.结论:HAMSC表面和胞质都表达HLLA-G,同时也分泌HLA-G到上清液中.HLA-G是HAMSC的免疫抑制功能的关键因素之一,这为HAMSC在移植后抑制排斥反应的临床应用提供了理论依据.
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羊膜干细胞分离方法及其细胞学特性鉴定
目的 按照Kobayashi方法从羊膜间充质细胞(AMCs)的侧群细胞(SP)中分离羊膜干细胞并予以细胞学特性鉴定.方法 按文献法取剖腹产手术胎盘,用色素染色法和流式细胞分选技术从AMCs中分离羊膜干细胞进行原代培养,用PI染色DNA分析细胞周期,软琼脂培养法观察细胞体外集落,并与人肝癌细胞系HepG2比较.结果 1.从AMCs中成功分离的(羊膜干细胞侧群细胞)AMCs-SP约占总AMCs的0.2%;2.细胞周期结果为AMC-SP细胞增殖缓慢或处于静止期;3.体外培养时细胞群体培增数达40以上,在软琼脂中AMC-SP不形成集落,与人肝癌细胞系HepG2可形成较大集落形成反差.结论 AMC-SP具有细胞来源充足、稳定性好、安全性高、无伦理学争议,异体移植无急性免疫排外反应,无致瘤性的优点,可做为再生医学及急性损伤期疾病治疗的重要的人细胞来源应用于临床.
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人羊膜间充质细胞的分离培养及其生物学特性探讨
目的：对人羊膜间充质细胞（hAMC）的分离培养及其生物学特性进行探讨。方法：取38～40周孕妇剖腹产术后羊膜，用多种酶消化分离提纯hAMC ，观察其体外生长的特征和形态学；用免疫细胞化学方法检测hAMC的神经及肝脏发生相关蛋白的表达；同时探讨其致瘤性。结果：从羊膜中分离出高纯度hAMC ，并摸索出其适合的培养条件；细胞成细长梭形或星形，胞质丰富，细胞核呈圆形，1～3个核仁，易贴壁，生长繁殖快，在体外可连续培养10代以上。免疫细胞化学结果显示：神经发生相关蛋白（Musashi‐1、Nestin、Vimentin）阳性以及肝脏发生相关蛋白[Flt‐1、In‐tegrinβ1、HNF（3β、4α、1α）、C／EBPα、Albumin、AAT ]等阳性；主要组织相容性复合体Ⅱ（Human M HC Class Ⅱ）阴性，主要组织相容性复合体Ⅰ（Human M HC Class Ⅰ）弱阳性；癌化实验显示hAMC无致瘤性。结论：羊膜中分离提纯的hAMC为一种具备多分化潜能的干细胞，至少可分化为神经及肝脏细胞。hAMC具有低免疫源性、无致瘤性等特点，为再生医学研究提供新的细胞来源。
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三种成体干细胞对脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症状态的影响
目的：比较人羊膜上皮细胞（（human amniotic epithelial cell, H-AEC））、羊膜间充质细胞（human amniotic mesenchymal cell, HA-MSC）和脐带间充质细胞（Umbilical cord mesenchymal stem cells, UC-MSC）分泌的细胞因子对脂多糖刺激巨噬细胞系RAW264.7炎症状态的影响。方法将LPS刺激的RAW264.7细胞炎症模型作为对照组，比较H-AEC、HA-MSC、UC-MSC和RAW264.7共培养或条件培养基培养RAW264.7对RAW264.7炎症状态的影响。比较各组RAW264.7细胞的迁移能力；检测各组细胞分泌一氧化氮（NO）的水平；用实时定量多聚酶链反应（RT-PCR）检测各组细胞经典激活的巨噬细胞（classically activated macrophage, M1 macrophage）相关的促炎基因如白介素-1β（IL-1β）、肿瘤坏死基因а（TNFа）、一氧化氮合成酶-2（NOS-2）以及M2 macrophage相关的抑炎基因如精氨酸酶（Arg-1）、甘露糖受体基因CD206、B类清道夫受体CD36）表达情况。结果（1）H-AEC、HA-MSC、UC-MSC处理后RAW264.7的迁移率分别为14.7%±4.5%、9.6%±0.7%、13.0%±0.9%，与对照组（31.1%±11.0%）相比，3种细胞的条件培养基处理后RAW264.7的迁移率均降低，差异具有显著性（P<0.05）；（2）H-AEC、HA-MSC、UC-MSC共培养后RAW264.7细胞分泌NO的水平分别为24.26±0.72、44.52±2.51、42.25±0.76μmol/L，与对照组（45.65±1.78μmol/L）相比，H-AEC组细胞分泌的NO有显著性下降（P<0.05）；（3）促炎基因与抑炎基因的表达改变：（A）H-AEC处理组促炎基因IL-1β、TNFа、NOS-2、INFβ的表达下调，与对照组相比有显著差别；HA-MSC、UC-MSC处理组促炎基因INFβ表达下调显著，其余基因均上调表达；抑炎相关基因如Arg-1、CD206、CD36均上调；（B）3组细胞干预后抑炎症相关基因Arg-1、CD206、CD36表达均上调，与对照组有显著差异。结论人羊膜上皮细胞、羊膜间充质细胞和脐带间充质细胞可以促进巨噬细胞向M2型分化，但其效果和机制存在不同。
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人羊膜间充质干细胞的分离、培养及鉴定
,hAMSCs具有骨髓间充质干细胞的表型特征.
