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新型重组免疫抑制融合毒素蛋白B7-2-PE40KDEL的分离纯化
为了建立高效快捷能分离大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的下游纯化路线,比较了不同组合的纯化策略和条件,包括反相层析、金属螯合层析、阴离子交换层析、蓝染料亲和层析和凝胶过滤层析等,并采用MTr法检测该融合蛋白的靶向杀伤活性.结果表明,在反相层析分离中疏水相分别采用了常规的甲醇和乙腈,结果为所分离的该重组融合蛋白均发生了变性,从色谱柱中分离出来就生成了絮状沉淀.在蓝染料亲和层析一步分离中,由于全菌体蛋白中与亲和树脂发生非特异结合的成分较多,极难区分目的蛋白和杂蛋白.但是,PRSETA-B7-2-PE40KDEL表达载体上带有翻译增强序列T7-g10,可在表达目的蛋白N端融合6个组氨酸,这十分有利于通过NiNTA金属鏊和层析法快速高纯度地纯化表达产物.根据这一特性,经反复筛选实验设计终确定了金属螯合层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步法的纯化路线,用于纯化分离B7-2-PE40KDEL融合蛋白.所得的目的蛋白的纯度可达95%以上,总回收率为8%.Western -blot实验显示,所得蛋白可与B7-2及PEA抗体特异性结合;MTr生物活性测定表明,该融合蛋白对表达CD28受体的人T细胞系Jurkat产生特异性杀伤作用,而对不表达CD28的淋巴细胞系Raji无任何杀伤作用.结论:建立了高效快速纯化大量重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白的技术路线,所纯化的重组B7-2-PE40KDEL融合蛋白能特异性靶向杀伤表达CD28受体的人T细胞.
关键词： 重组外毒素融合蛋白 B7-2-PE40KDEL 蛋白纯化 靶向杀伤 生物活性 -
信号转导及转录激活因子1通路在肿瘤中的研究进展
信号转导及转录激活因子1(STAT1)被干扰素及其他信号分子激活,进而移入胞核活化其靶基因的转录.STAT1通路激活主要介导抗病毒防御及肿瘤抑制功能,同时它在肿瘤调控方面也可能发挥着抑癌基因的功能.但STAT1通路激活后亦能赋予肿瘤细胞对抗DNA损伤及促进肿瘤生长、侵袭的能力,故认为它是一种具有致癌作用的基因.因此,对Janus激酶/STAT1抑制剂和特异性作用于STAT1蛋白多肽类抑制剂的研究,将提供一种新的肿瘤靶向杀伤策略.
关键词： 肿瘤 信号转导及转录激活因子1 靶向杀伤 -
体外联合应用CD80和CD28/CpG ODN共刺激活化人外周血单个核细胞:对胃癌细胞株MKN45有靶向杀伤作用吗?
背景:启动维持并调节活化级联反应,决定了T细胞是活化增殖或转变为无反应状态甚至凋亡.B7分子与CD28的结合能有效协同T细胞受体途径活化T细胞,增强T细胞的增殖活性. 目的:初步分析CD80和CD28/含CpG的寡脱氧核苷酸(CpG containing oligodeoxynucleotides,CpG ODN)共刺激活化的人外周血单个核细胞对胃癌细胞株MKN45的杀伤作用.方法:Ficoll密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,加入白细胞介素2及CD28,CpG ODN共刺激活化培养1～5 d.取MKN45细胞,设立4组:CD28/CpG ODN共刺激组、CD80联合CD28/CpG ODN共刺激组、单纯CD80组、空白对照组.以MTT法检测细胞杀伤率,电镜观察凋亡的MKN45细胞超微结构,流式细胞仪检测MKN45细胞凋亡率.结果与结论:单纯CD80组对MKN45细胞无明显杀伤作用;与CD28/CpG ODN共刺激组比较,CD80联合CD28/CpG ODN共刺激组对MKN45细胞的杀伤作用显著增强(P < 0.05),效应细胞与靶细胞之比达15︰1时即可达到半数杀伤率.电镜下效应细胞作用24 h,MKN45细胞就部分发生坏死,部分细胞可见凋亡.与空白对照组比较,单纯CD80组MKN45细胞凋亡率显著升高(P < 0.01).提示CD80与共刺激活化的外周血单个核细胞合用,可提高活化的外周血单个核细胞对MKN45细胞的靶向性杀伤作用.
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CD90+肝癌干细胞的鉴定及靶向治疗研究
目的:对人肝癌组织和细胞株BEL-7404中的CD90+细胞进行干细胞特性鉴定;制备载17-AAG的抗CD90磁性热敏脂质体(CD90@17-AAG/TMs)靶向杀伤CD90+肝癌干细胞(liver cancer stem cells,LCSCs).方法:利用免疫组化染色检测人肝癌组织中CD90的表达,并研究其与肝癌临床病理特征的关系;利用免疫磁珠分选法从人肝癌细胞株BEL-7404中分离出CD90+LCSCs并验证其干细胞特性;“旋转蒸发-水化法”制备CD90@17-AAG/TMs,通过体内杀伤实验验证其杀伤CD90+ LCSCs的能力.结果:CD90的表达与患者性别、年龄、肿瘤大小、甲胎蛋白(AFP)无关(P＞0.05),与病理分级有关(P＜0.05);肝癌细胞中CD90+细胞具有明显的干细胞特性;CD90@17-AAG/TMs在体内可以有效杀伤CD90+ LCSCs,抑制肝癌的生长.结论:CD90+细胞具有明显的干细胞特性,采用CD90@17-AAG/TMs可有效清除CD90+LCSCs,抑制肝癌的形成及生长,为肝癌及其他恶性肿瘤的治疗提供了新的手段.
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白细胞介素2-重组毒素对活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应
利用PCR-Cloning技术和DNA重组技术,构建了两类IL-2-PE40' 嵌合基因的表达载体,分别由IPTG和温度(42 ℃)诱导表达.在对表达产物进行了酶切位点和片段大小、电泳迁移率、分子量的初步鉴定后,又对融合蛋白的白细胞介素2(IL-2)和PE40'组分的抗原性进行了ELISA鉴定.从菌体蛋白中初步分离纯化了重组毒素,并测定其对细胞表面表达IL- 2受体的活化T淋巴细胞的靶向杀伤效应及对混合淋巴细胞反应的抑制作用.结果表明,IL-2-PE40'融合蛋白确实对IL-2R+ 细胞具有明显的靶向杀伤效应并呈剂量依赖关系,与对照组相比,随着保温时间的延长(6、24、48 h),杀伤效应趋于增强(P＜0.05). 混合淋巴细胞培养结果显示,该融合蛋白对单相和双相反应均有不同程度的免疫抑制作用(P＜0.01).
