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细粒棘球蚴Eg95重组表位蛋白的免疫特性研究
目的 研究Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3表位蛋白的抗原性,为细粒棘球蚴多表位疫苗的研制奠定基础. 方法 构建细粒棘球蚴Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3抗原原核表达载体并体外诱导表达重组蛋白,纯化后免疫家兔,制备Eg95抗原多克隆抗体,采用Western blot检测Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3抗原与Eg95多抗的反应性;分别用重组蛋白Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3免疫BALB/c小鼠,采用ELISA检测小鼠血清特异IgG水平,MTT法检测脾淋巴细胞增殖. 结果 用Western blot检测重组蛋白Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3均能与Eg95多抗血清反应,以Eg95-2和Eg95-3反应性较强.用Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3重组抗原免疫小鼠后,随着免疫次数的增加和时间的延长,小鼠血清IgG水平升高,小鼠脾淋巴细胞在体外经ConA和Eg95抗原刺激诱导发生增殖. 结论 构建的3个表位均为Eg95的有效抗原表位,用重组抗原Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3免疫小鼠后均可诱导以产生IgG为主的体液免疫应答,因此构建的3个表位蛋白抗原可用于细粒棘球蚴多表位肽疫苗的研制.
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细粒棘球蚴表位质粒的构建和噬菌体展示
目的 合成Eg95 T-B联合表位肽段,通过噬菌体展示技术获得含不同联合表位的肽段,为细粒棘球蚴病的多抗原表位疫苗的研制奠定基础. 方法 采用DNAman软件设计3对相应引物,分别扩增各段联合表位的核苷酸序列,连接PMD18-T载体,PCR扩增测序正确的序列,然后用T4连接酶将各段外源基因重组到M13KE噬菌体载体上,构建M13KE/Eg95-1、M13KE/Eg95-2和M13KE/Eg95-3质粒,转入大肠埃希菌ER2738感受态细胞中,运用PCR方法对插入序列进行初步鉴定,测序确定序列正确且无基因突变.使各段基因所对应的外源肽融合表达于M13KE噬菌体PⅢ蛋白上,通过PEG/NaCl沉淀法提纯重组噬菌体. 结果 成功构建了M13KE/Eg95-1 M13KE/Eg95-2与M13KE/Eg95-3噬菌体展示系统,PCR扩增Eg95-1、Eg95-2、Eg95-3片段分别为192、168和222 bp,与预期大小一致. 结论 成功构建了T细胞和B细胞联合表位的噬菌体展示系统,为抗原表位的筛选奠定了基础.
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细粒棘球蚴Eg95蛋白减毒沙门氏菌重组株的构建与免疫原性分析
目的 探讨以减毒鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)为载体构建细粒棘球蚴口服活载体疫苗的可行性.方法 将细粒棘球蚴Eg95基因插入到表达载体pYA3341中,构建重组质粒pYA3341-Eg95,并用PCR和酶切鉴定.将重组质粒先后电转入减毒沙门氏菌X3770和X4550,获得重组菌株St-Eg95,蛋白质印迹(Western blotting)分析重组菌Eg95蛋白的表达情况.将重组菌St-Eg95体外培养传10代,每隔一代提取质粒,利用PCR鉴定重组质粒的稳定性.BALB/c小鼠30只,随机均分为6组,其中4组分别经口灌胃给予St-Eg95 1×109、1×1010、1×1011和1 ×1012 cfu/ml,100 μl/只,余下2组分别经口灌胃给予等体积野生型沙门氏菌1×107 cfu/ml和PBS,常规饲养30 d,观察生存情况.另取15只BALB/c小鼠,均分为3组,分别为St-Eg95免疫组、阴性对照组和空白对照组,St-Eg95组和阴性对照组按5×1010 cfu/ml剂量的重组菌和阴性菌分别经口灌胃免疫小鼠,0.5 ml/(只·次),共2次,间隔2周.分别于免疫前和末次免疫后2、4和6周采血,收集血清.用细粒棘球蚴IgG抗体检测试剂盒(间接ELISA)检测Eg95蛋白的IgG抗体滴度.于末次免疫后6周处死小鼠,用噻唑蓝(MTT)法检测特异性脾淋巴细胞增殖活性.结果 经PCR和酶切鉴定表明,重组质粒pYA3341-Eg95构建成功,在重组菌St-Eg95中有目的蛋白Eg95的表达,相对分子质量(Mr)约为18 000,与预期大小一致.重组菌传10代后,PCR仍可扩增到约486 bp的Eg95基因片段.安全性实验结果显示,灌胃给予重组菌和PBS的小鼠30 d后均存活,活动正常;给予野生型沙门氏菌的小鼠均于4d后死亡.间接ELISA检测结果显示,末次免疫后2周St-Eg95组小鼠特异性IgG抗体水平即明显升高,显著高于阴性对照组和空白对照组(P＜0.05);末次免疫后4周抗体水平达到高值,约1:1 700.小鼠淋巴细胞增殖试验结果显示,末次免疫后6周,St-Eg95组小鼠的脾淋巴细胞刺激指数(SI值)达到1.94±0.15,显著高于阴性对照组(1.14±0.12)和空白对照组(1.03±0.03)(P＜0.05).结论 构建了能稳定表达细粒棘球蚴Eg95蛋白的口服减毒沙门氏菌重组株,并具有良好的免疫原性和安全性.
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细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗的构建
目的 构建细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95).方法 分别以卡介苗BCG基因组DNA和pGEX-4T-Eg95重组质粒为模板,PCR扩增获117 bp的BCG抗原85B(BCG-Ag85B)信号肽序列和471 bp的Eg95基因序列.将这两个序列定向克隆至大肠埃希菌-BCG穿梭质粒pMV261,经酶切、PCR扩增及测序鉴定得到重组质粒pSMEg95.电穿孔法将重组质粒导入BCG菌构建rsBCG-Eg95疫苗,卡那霉素抗性基因筛选并经PCR扩增鉴定.结果 质粒pSMEg95经双酶切、PCR扩增及测序鉴定,证实克隆基因Ag85B信号肽和Eg95基因序列正确插入载体pMV261,并将此重组质粒导入BCG菌,经PCR扩增鉴定证实细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗(rsBCG-Eg95)构建成功.结论 构建了含有BCG信号肽Ag85B和保护性抗原Eg95基因序列的细粒棘球绦虫Eg95重组分泌型卡介苗rsBCG-Eg95.
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细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗的构建
目的 分别构建细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型卡介苗及耻垢分枝杆菌疫苗.方法 分别以卡介苗(BCG)基因组DNA和PGEX-4T-Eg95为模板,PCR扩增获120bp的BCG抗原85B信号肽序列和423bp的Eg95基因序列.先将Eg95基因序列定向克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭质粒pMV261,构建非分泌型重组质粒pMEg95.再将BCG-Ag85B信号肽序列定向克隆至pMEg95,构建分泌型重组质粒pSMEg95.电穿孔法将两型重组质粒分别导入BCG菌及耻垢分枝杆菌.结果 双酶切、PCR扩增及测序鉴定证实,克隆基因EG95序列和AG85B信号肽序列正确插入载体PMV261,细粒棘球绦虫EG95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗构建成功.结论 构建了含有Eg95基因序列和BCG-Ag85B信号肽序列的细粒棘球绦虫Eg95重组非分泌型和分泌型分枝杆菌疫苗.
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细粒棘球绦虫EG95基因的克隆和序列分析
目的获得细粒棘球蚴EG95基因序列资料,进行序列分析,为研究包虫病疫苗候选抗原基因奠定基础.方法 从包囊内获取细粒棘球蚴原头蚴(protoscoleces),提取RNA和DNA,用特异引物分别以基因组DNA和cDNA为模板扩增EG95基因;并将其克隆到T载体后进行序列测定和分析.结果以基因组为模板获得一个基因,长度为1253bp,以cDNA为模板获得两个基因,长度分别为1121bp和833bp;同源性比较结果表明:来自新疆羊源EG95基因序列和澳大利亚羊源EG95-2基因同源性为98%,有13个碱基变异;从cDNA获得的EG95基因(EG95-like)和DNA来源的EG95相同,只是EG95序列的一部分;从cDNA获得的另一个EG95基因(mEG95)和澳大利亚源EG95-2同源性为99%,有2个碱基不同.分析表明EG95是一个基因家族,可能是虫体发育到六沟蚴阶段特定表达的基因.结论 EG95是一个基因家族,进一步研究该基因家族的结构和功能对包虫病的免疫预防具有重要意义.
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棘球蚴(包虫)病预防疫苗的研制与应用
棘球蚴(包虫)病的控制是一个长期的过程.20世纪90年代以前,寄生虫病的防治手段主要是药物防治,但近年来,由于寄生虫耐药风险的增加和不理想的控制效果,以及大面积药物的使用对环境的不良影响等,寄生虫病控制的研究方向逐渐向免疫预防转移.本文从棘球绦虫疫苗研制的策略,中间宿主和终末宿主抗虫疫苗的研制,以及所面临的挑战和机遇等做一综述.在我国,EG95已经大面积接种绵羊用于囊性包虫病的控制.但泡球蚴病病原的传播是循环于犬,狐狸和狼等终末宿主和鼠类之间,终末宿主抗虫疫苗研制是泡球蚴病控制研究的方向之一.
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细粒棘球绦虫Eg95抗原表位的生物信息学预测
目的 应用软件和在线网络分析Eg95的蛋白二级结构,预测B细胞表位和T细胞表位,为确定和筛选优势表位,研制安全、高效的表位疫苗奠定基础.方法 采用DNAStar软件和在线网站IEDB、SYFPEITHI等对Eg95的B细胞表位和T细胞表位进行预测.结果 Eg95存在潜在的抗原表位,B细胞表位区域:16-38,41-48,50-67,68-90,92-100,103-113,120-132.分值高的T细胞表位区域:6-14,14-22,48-56,4-12,98-106, 142-150, 146-154.结论 运用生物信息学方法确定Eg95存在7个抗原表位,对进一步研究Eg95的抗原性和研发优势表位疫苗具有重要的意义.
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细粒棘球绦虫Eg95疫苗的研制现状
囊型棘球蚴病是一种严重危害人类健康的人兽共患寄生虫病,采用疫苗防治该病是当前研究的热点领域之一.Eg95是一种有效的疫苗候选分子,其疫苗种类有重组抗原、合成肽疫苗、DNA疫苗、重组酵母、重组牛痘病毒疫苗、重组BCG疫苗、转基因苜蓿疫苗和重组双歧杆菌疫苗等.
