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结核分枝杆菌Pup、 Dop 、PafA 、Mpa基因重组穿梭表达质粒的构建及鉴定
目的 构建结核杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统中Pup、Dop、PafA和Mpa基因的重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,并对其进行鉴定. 方法 提取结核杆菌国际标准强毒株H37Rv基因组DNA,以此为模板PCR扩增Pup、Dop、PafA和Mpa基因编码序列并测序.扩增产物克隆至大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361,并转化E.coli DH5α感受态细胞,利用PCR技术、双酶切技术及基因测序技术对构建的重组穿梭表达质粒进行鉴定. 结果 PCR扩增的Pup、Dop、PafA和Mpa基因片段分别为213、1 683、1 377、和1 848 bp,与预期长度一致;双酶切鉴定Pup、Dop、PafA和Mpa基因均成功插入穿梭表达质粒pMV361,测序显示插入穿梭表达质粒pMV361的Pup、Dop、PafA和Mpa基因序列与GenBank公布的序列一致. 结论 成功构建了重组大肠埃希菌-分枝杆菌穿梭表达质粒pMV361/Pup、pMV361/Dop、pMV361/PafA和pMV361/Mpa,为进一步研究结核分枝杆菌泛素样蛋白-蛋白酶体系统奠定了基础.
关键词： 结核分枝杆菌 泛素样蛋白-蛋白酶体系统 pMV361 重组穿梭表达质粒 -
泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性机制研究
目的 探讨泛素样蛋白蛋白酶体系统对单耐异烟肼结核分枝杆菌耐药性的影响及其机制. 方法 采用刃天青显色法,比较单耐异烟肼结核分枝杆菌(对照组)与4种基因(Pup、Dop、PafA、Mpa基因)分别过表达和缺失单耐异烟肼结核分枝杆菌菌株异烟肼低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值的差异;比较加入改变细胞壁通透性试剂后,单耐异烟肼结核分枝杆菌(对照组)与4种基因分别过表达和缺失单耐异烟肼结核分枝杆菌菌株异烟肼MIC差值问的差异. 结果 (1)与单耐异烟肼结核分枝杆菌相比,异烟肼的MIC值过表达PafA基因株增加1.03 μg/ml,过表达Dop、Mpa基因株分别降低1.03 μg/ml、0.68 μg/ml,差异均无统计学意义(F=1.898,P＞0.05);过表达Pup基因株异烟肼的MIC值增加8μg/ml,差异有统计学意义(t=2.185,P＜0.05);缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因株异烟肼的MIC值分别降低4.82、4.98、4.99、4.9 μg/ml,差异均有统计学意义(F=35.809,P＜0.05).(2)与加入改变细胞壁通透性试剂后单耐异烟肼结核分枝杆菌相比,异烟肼的MIC差值过表达Pup基因l株增加7.78 μg/ml,差异有统计学意义(t=2.173,P＜0.05);缺失Pup、Dop、PafA、Mpa基因株分别降低4.58、4.73、4.75、4.68 μg/ml,差异均有统计学意义(F=33.598,P＜0.05);过表达Dop、Mpa基因株分别降低1μg/ml和0.7μg/ml,过表达PafA基因株增加0.97 μg/ml,差异均无统计学意义(F=1.935,P＞0.05). 结论 结核分枝杆菌泛素样蛋白蛋白酶体系统可能通过调控单耐异烟肼结核分枝杆菌细胞壁的通透性影响其耐药性.
关键词： 结核分枝杆菌 泛素样蛋白-蛋白酶体系统 耐药性 异烟肼 机制 -
泛素样蛋白-蛋白酶体系统与结核分枝杆菌致病性的相关性研究进展
结核分枝杆菌(Mycobacterium Tuberculosis,MTB)中的泛素样蛋白蛋白酶体系统(prokaryotic ubiquitin-likeprotein-proteasome system,PPS),主要介导和调控MTB体内蛋白质的降解.在特定环境下,MTB中泛素样蛋白(prokaryotic ubiquitin-like protein,Pup)选择性标记特定的蛋白质,并在辅助因子的帮助下将靶蛋白送入蛋白酶体内降解,对MTB在宿主体内的生长、繁殖及致病性发挥重要调控作用.本文首先简单介绍了MTB中Pup、蛋白酶体的结构特点、作用及PPS降解靶蛋白的主要过程,接着重点介绍了PPS对MTB致病性的调控机制,及如何通过改变PPS作用来降低MTB致病性等一些新进展,希望能够为寻找新型抗结核药物提供方向.
关键词： 结核分枝杆菌 泛素样蛋白-蛋白酶体系统 蛋白酶体 致病性
