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间日疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析
目的 研究不同地理株间日疟原虫(Pv)裂殖子顶端膜抗原1(AMA-1)基因多态性. 方法 采集镜检确诊的间日疟患者滤纸血 3滴,煮沸法提取滤纸血中pv DNA,套式PCR扩增包含PvAMA-1Ⅱ区(793 bp)DNA片段,扩增产物经电泳鉴定后纯化并测序,利用生物软件进行序列比对分析. 结果 17例患者感染的间日疟原虫分为9种单倍型,只有1种(V3)在基因库中未发现100％吻合的序列;含9个多态位点(s-9),核苷酸多样度(π)为0.00859±0.00093,非同义突变率1引同义突变率差值(dN-dS)为-0.00230±0.00539,但Z检验差异无统计学意义(P＞0.05).中性检验差异均无统计学意义(P＞0.05).重组事件的低数量(Rm)为2,在整个411 bp序列中R2随着核苷酸遗传距离增加呈下降趋势不明显. 结论 间日疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)Ⅱ区基因序列遗传多样性程度较低.
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携带恶性疟原虫ama1基因的重组MVA构建及免疫性分析
目的构建稳定表达恶性疟原虫(Pf)顶端膜抗原1(AMA1)的重组改良安卡拉痘苗病毒(MVA),对其诱导小鼠免疫应答的特性进行分析. 方法构建包含Pf AMA1编码基因的重组载体pⅢdHR.ssp/E,转染MVA感染的BHK21细胞,经同源重组插入MVA基因组的deletionⅢ位点,利用宿主范围基因k1l在RK13细胞中对rMVA进行瞬时筛选,用获得的rMVA/E(K1L)感染BHK21并进行传代,经内部同源重组去除k1l后获得rMVA/E.采用PCR、IFA和Western blot对rMVA/E的基因组序列和重组抗原的表达情况进行鉴定.用不同剂量的rMVA/E经腹腔接种免疫BALB/c小鼠,ELISA检测特异性抗体应答的水平并分析IgG亚类(IgG1和IgG2a),取脾细胞用重组抗原在体外进行刺激增殖. 结果获得了可稳定表达Pf AMA1的重组MVA,经3次腹腔接种不同剂量(107～108 TCID50)后的rMVA/E诱导BALB/c小鼠产生了水平相当(P＞0.1)的抗AMA1抗体,其IgG亚类以IgG2a为主,各免疫组脾细胞在体外对AMA1抗原的再刺激均产生了明显的回忆应答. 结论成功构建了携带Pf ama1基因的重组MVA.rMVA/E可诱导小鼠产生AMA1特异的免疫应答.
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恶性疟原虫AMA1不同类型疫苗组合免疫接种研究
目的探索应用恶性疟原虫DNA疫苗、重组痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种,诱导针对恶性疟原虫红内期抗原AMA1的保护性抗体.方法 PCR扩增云南株恶性疟原虫AMA1编码基因,构建和制备DNA免疫质粒VR1020/E(疫苗D)、重组改良安卡拉痘苗病毒rMVA/E(疫苗V)和重组原核表达AMA1胞外域蛋白E(疫苗P).用疫苗D单独或与小鼠GM-CSF表达质粒共同对小鼠进行初始免疫,用疫苗V和疫苗P进行单次或先后各一次追加强化.采用疫苗D-V组合方案免疫新西兰白兔.ELISA测定小鼠血清IgG及其亚类IgG1和IgG2a的水平,用免疫动物血清进行疟原虫裂殖子体外入侵抑制实验.结果在疫苗D初始免疫的基础上,采用疫苗V或疫苗P进行强化免疫可显著提高小鼠针对AMA1的抗体应答,小鼠血清特异性IgG平均增加15至137倍,GM-CSF表达质粒对疫苗D-V组合免疫小鼠的抗体应答有显著促进作用.采用疫苗D-V组合免疫在家兔可诱导明显的抗体应答.小鼠和家兔免疫血清在体外可显著抑制疟原虫裂殖子对RBC的入侵.结论将DNA疫苗、重组改良安卡拉痘苗病毒疫苗和重组蛋白疫苗进行组合免疫接种是诱导疟疾红内期保护性抗体的有效方法.
关键词： 恶性疟原虫 疫苗 顶端膜抗原1 改良的安卡拉痘苗病毒 -
恶性疟原虫顶端膜抗原1基因多态性分析
目的 研究不同地理分离株恶性疟原虫裂殖子顶端膜抗原1(PfAMA-1)基因的多态性.方法 采集2006-2012年福建省23例输入性恶性疟患者的血样,以血样中的疟原虫DNA为模板,巢式PCR扩增AMA-1基因片段,利用生物软件进行序列比对分析.结果 23份血样均扩增出目的条带(约505 bp),发现32个多态位点,共计18个单倍型,其中8个为新报道序列.来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性[单倍型多样度(Hd)=0.985,核苷酸多样度(π) =0.0258],亚洲(东南亚和中国云南)的遗传多样性相对较低(Hd=0.909,π=0.0221).多样化选择分析结果显示,非同义突变率与同义突变率差值(dN-dS)为0.031±0.006,中性检验结果均无统计学意义(P＞0.05).基因内重组分析显示,重组事件的低数量(Rm)为10,连锁不平衡指数R2随核苷酸遗传距离增加呈明显下降趋势.采用邻接法构建的分子系统树显示,所有分离株分为3个群(G1,G2和G3),Gl多为非洲分离株,G3大部分为亚洲分离株.结论 来自非洲的恶性疟原虫分离株的AMA-1基因序列具有较丰富的遗传多样性.
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伯氏疟原虫顶端膜抗原1胞外区及其亚区的表达与免疫保护作用分析
目的 表达伯氏疟原虫顶端膜抗原1(PbAMA-1)胞外区E及其各亚区,分析其免疫原性和免疫保护作用.方法 抽提伯氏疟原虫基因组,对PbAMA-1基因测序,依据该序列采用毕赤酵母密码子使用频率重新设计PbA-MA-1基因序列.将其胞外区E分为3个彼此重叠的基因片段D Ⅰ、DⅡ和DⅢ并进行优化,人工合成后在大肠埃希菌中诱导表达.表达产物经纯化和重折叠,分别与福氏佐剂乳化后免疫小鼠和家兔,均免疫3次,间隔2周.每次免疫剂量,小鼠为20μg,家兔为100μg.ELISA检测抗体效价,并以疟原虫攻击实验确定各抗原的免疫保护效果.结果 测得的PbAMA-1基因序列与Sanger测序中心公布的序列完全一致.密码子优化并人工合成的D Ⅰ、DⅡ、DⅢ和E目的基因片段在大肠埃希菌表达载体pET32a均获得诱导表达,经十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,各目的基因表达产物大小与预计的相对分子质量Mr 44 300、Mr33 300、Mr 29 900和Mr 67 200相一致.表达产物经镍离子螯合柱(Ni-NTA柱)纯化和谷胱甘肽(GSH)氧化还原法体外重折叠,蛋白纯度达90%以上,各纯化的重组蛋白在小鼠体内均激发产生高滴度抗体.其中,完整的胞外区E第3次免疫后抗体滴度为(34.4±0.15)×10-4,与其他组相比,免疫原性较其他各亚区更强(t=5.66,P＜0.01;t=2.27,P＜0.05和t=5.05,P＜0.01).取家兔免疫血清与感染伯氏疟原虫ANKA株的小鼠血膜抗原片进行间接荧光抗体试验(IFAT),均为阳性,其中抗E的抗血清免疫荧光强度高,与ELISA检测的抗体水平一致.取家兔抗血清对小鼠伯氏疟原虫粗提抗原进行蛋白质印迹(Western blot)分析,产生特异性反应条带,表明能够识别天然的PbAMA-1蛋白.免疫小鼠在以伯氏疟原虫攻击实验中得到部分保护,D Ⅰ、DⅡ、DⅢ和E各免疫组小鼠与佐剂对照组相比,存活时间明显延长(t=2.78,P＜0.05;t=2.67,P＜0.05;t=3.46,P＜0.01和t=3.50,P＜0.01).结论 人工合成的PbAMA-1具有良好的免疫原性和免疫保护作用,完整的胞外区E较其各亚区表现出更好的免疫原性.
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细胞因子表达质粒对恶性疟原虫顶端膜抗原1DNA免疫的调节作用
目的探讨细胞因子表达质粒对小鼠DNA免疫的促进和调节作用.方法构建编码恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA1)完整胞外域的DNA免疫质粒VR1020/E,构建编码小鼠细胞因子(GM-CSF)、白细胞介素(IL)如IL-4和IL-12的真核表达质粒pcDNA3/GM-CSF、pcDNA3.1(-)/IL-4和pIL-12以及双顺反子质粒pGM-CSF/pTPA-E,分组免疫小鼠,ELISA检测血清中特异性IgG及其亚类的水平,取小鼠脾细胞进行体外增殖.结果3种细胞因子质粒均有效增强了小鼠针对VR1020/E的免疫应答,抗体水平增加7至10倍,其中pcDNA3/GM-CSF质粒和pIL-12质粒分别显著促进了小鼠的IgG1和IgG2a应答,小鼠脾细胞的体外增殖水平亦有明显提高.结论利用编码GM-CSF、IL-4和IL-12的表达质粒作为佐剂可有效增强小鼠针对AMA1 DNA的免疫应答,并对免疫应答的类型产生调节作用.
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重组表达的恶性疟原虫顶端膜抗原1片段诱导小鼠保护性抗体应答
目的分析恶性疟原虫顶端膜抗原(apical membrane antigen1,AMA1)主要结构域在诱导保护性抗体应答中的作用,为正确选择疫苗应用片段提供依据.方法PCR扩增编码P.fAMA1相应结构域的基因序列,构建pET原核表达载体,用纯化重组蛋白免疫BALB/c小鼠,ELISA测定抗体效价,用免疫荧光和免疫印迹分析抗体的特异性,用小鼠免疫血清进行疟原虫体外生长抑制实验.结果成功表达并纯化了代表AMA1不同结构域的重组抗原片段,包括完整的胞外域片段E、结构域Ⅰ+Ⅱ、Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,免疫小鼠后分别诱导出不同滴度的IgG抗体,免疫血清可特异地识别天然AMA1抗原,重组蛋白E和Ⅰ十Ⅱ免疫血清可明显抑制疟原虫的体外生长.结论AMA1胞外结构域的完整性是构成保护性抗体表位的重要基础,保护性抗体表位主要分布在结构域I中.
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应用四环素调控系统建立可调控抗恶性疟原虫DNA疫苗的初步研究
目的: 应用四环素(tetracycline, Tet)可调控系统建立可调控的抗恶性疟原虫的DNA疫苗.方法: 首先构建恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)基因和转录激活因子(tTA或rtTA)基因的真核表达质粒pTL-8/AMA-1和pTL-8/AMA-1(rtTA), 并大量制备这两种质粒及表达转录抑制子(tTS)的质粒pUHS6-1.以pTL-8/AMA-1、pTL-8/AMA-1(rtTA)和pTL-8/AMA-1(rtTA)加pUHS6-1/tTS免疫小鼠后, 用四环素类似物强力霉素(doxcycline, dox)诱导或抑制上述DNA载体内AMA-1的表达, 并分离小鼠血清检测针对AMA-1抗体的表达情况.结果: ①构建了真核表达质粒pTL-8/AMA-1和pTL-8/AMA-1(rtTA); ②pTL-8/AMA-1和pTL-8/AMA-1(rtTA)在没有被诱导表达时(仅基础表达), 可诱导明显的免疫应答.在以pTL-8/AMA-1(rtTA)与含tTS的pUHS6-1共同免疫后, 可极大地降低其免疫应答.应用dox诱导pTL-8/AMA-1(rtTA)中的AMA-1基因表达后, 可明显引起免疫应答.结论: pTL-8/AMA-1(rtTA)附加pUHS6-1构成了可调节的DNA免疫系统.该系统的建立将对进一步深入研究DNA疫苗的免疫机制和调控基因表达, 减少不良免疫反应以及进行可精确调控的基因治疗打下一定的基础.
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恶性疟原虫顶端膜抗原1基因转染伯氏疟原虫模型的建立
目的: 建立恶性疟原虫顶端膜抗原1(AMA-1)基因转染伯氏疟原虫的模型. 方法: 将含有恶性疟原虫AMA-1基因的重组转染质粒pDB.DTm.DB./AB.AF.DB.用BglI酶切线性化. 伯氏疟原虫经体外培养和分离后进行电转化,转化的原虫经药物筛选后进行PCR检测. 结果: PCR检测显示转染伯氏疟原虫存在恶性疟原虫AMA-1基因. 结论: 成功建立了恶性疟原虫AMA-1基因转染伯氏疟原虫的模型,为进一步研究提供了基础.
