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纤溶酶原Kringle 5的抑制血管增生作用
纤溶酶原Kringle 5是纤溶酶原中与血管抑素相连的另一个联环结构域,它能抑制内皮细胞的增殖、迁移,并能诱导内皮细胞凋亡和细胞周期停滞,具有很强的抑制血管生成活性,是抑制活性强的纤溶酶原水解片段.同时它具有分子量小、性质稳定、毒副作用小、特异性高等优点,是一个有潜在临床应用价值和开发前景的治疗血管增生性疾病的药物.
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重组人kringle 5蛋白滴眼液抑制兔角膜新生血管的研究
目的观察重组人kringle 5(K 5蛋白)滴眼液抑制碱烧伤诱导的兔角膜新生血管(neovascularization, NV)的效果,探讨其作用机制.方法采用基因重组方法获得K 5蛋白,取新西兰白兔40只,将浸有1 mol/L氢氧化钠滤纸片置于兔角膜中央,制成碱烧伤模型,随机均分为A、B、C及D组,每组10只兔(10只眼),伤后即分别滴用5、10及20 mg/L的K 5蛋白滴眼液,对照(D)组滴载体溶液;均每日4次,共滴28 d.裂隙灯显微镜下观察角膜NV生长情况,并计算其面积,伤后28 d处死实验兔(A、B及C组),取其角膜片做组织病理学检查.结果伤后A、B、C及D组角膜NV开始出现的时间分别为(3.4±0.5) d、(6.8±0.4) d、(6.7±0.7) d及(3.7±0.5)d,其中B组明显较D组延长(P<0.05),而A组与D组间差异无显著意义(P>0.05).伤后各时间点B及C组角膜NV的生长面积均明显较D组减少(P<0.05),B与C组角膜NV区面积间比较,差异无显著意义(P>0.05).角膜组织病理学检查,D组烧伤区可见大量炎性细胞浸润及角膜NV形成,而B及C组角膜炎性反应较轻,烧伤区无NV形成.角膜NV区面积与角膜后膜和炎性细胞数均有明显相关性(P<0.05).结论重组人K 5蛋白滴眼液可明显抑制碱烧伤引起的角膜NV的生长,抑制效果呈剂量依赖性.
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转染人血纤溶酶原Kringle 5基因对人胰腺癌PC3细胞的影响
目的将人血纤溶酶原Kringle 5基因导入人胰腺癌PC3细胞,观察其对人胰腺癌PC3细胞系的基因治疗作用.方法将外源性Kringle 5通过脂质体转染法导入人胰腺癌PC3细胞,筛选阳性克隆,同时设空质粒组及PC3细胞为对照.采用RT-PCR、免疫组织化学、MTT、电镜、流式细胞术等方法,鉴定及检测转染前后细胞超微结构、细胞周期及Kringle 5蛋白表达情况,并用血管内皮细胞增殖实验及裸鼠接种检测目的胰腺癌细胞株表达的Kringle 5蛋白抑制血管内皮细胞生长的活性及裸鼠移植瘤生长情况.结果人血纤溶酶原Kringle 5基因及蛋白水平在胰腺癌PC3细胞系均可以稳定表达,能抑制ECV304血管内皮细胞生长及具有抑制裸鼠移植瘤生长的作用.结论成功转染人Kringle 5基因的人胰腺癌PC3细胞可稳定表达Kringle 5蛋白,且具有抗血管内皮细胞增殖活性的良好作用,为进一步进行体内抗血管生成基因治疗奠定了基础.
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重组Kringle5蛋白发酵工艺的优化
目的:建立优化重组Kringle5蛋白发酵工艺.方法:应用高密度发酵法建立并优化含Kringle5表达载体的工程菌的发酵技术,采用紫外分光光度计检测菌体密度(A600),称量菌体干重,并经SDS-PAGE检测Kring]e5蛋白表达量.结果:重组Kringle5蛋白工程菌高密度发酵的优化条件为:BP-5菌种,2×YT培养基,30°C基础培养时间7h,42℃诱导培养时间6h,pH值为7.0,空气流量为lvvm,溶氧控制大于50％,搅拌转速控制为800～1 200 r/min;目的蛋白占全菌总蛋白的38.4％,菌体干重达( 14.28±0.1i)g/L.结论:已建立并优化了重组Kringle5蛋白的高密度发酵工艺,为其新药开发奠定了技术基础.
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携带Kringle 5基因重组腺病毒的构建及其对荷肺癌小鼠生存期的作用
目的:构建携带人纤溶酶原Kringle 5(K5)基因重组腺病毒并观察其在小鼠肺癌细胞中的表达和对荷TC-1瘤小鼠的生存期的影响.方法:构建携带人纤溶酶原K5基因表达框的腺病毒载体Ad-EF1α-K5,用RT-PCR法检测腺病毒感染TC-1细胞后K5 mRNA的表达,用免疫沉淀和Western bloting法检测腺病毒感染TC-1细胞后K5蛋白的表达.建立荷TC-1小鼠肺癌C57BL/6小鼠模型,观察重组腺病毒对荷瘤小鼠生存期的影响.取肿瘤组织做免疫组织化学染色并计数微血管密度.结果:携带K5基因的人V型腺病毒能有效感染小鼠肺癌TC-1细胞,在转录和翻译水平进行表达,能有效延长荷瘤鼠的生存期并降低肿瘤微血管密度.结论:腺病毒可作为便捷的载体携带K5基因感染肿瘤细胞,分泌表达K5蛋白,延长荷瘤小鼠生存期,可能与其通过抑制肿瘤区血管生成、遏制肿瘤区血供有关.
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Kringle 5的药理特性及其在眼科的应用
Kringle 5(K5)是人纤溶酶原的蛋白水解片断,是一种新近发现的血管增生抑制因子,经实验证明为抑制活性强的纤溶酶原水解片段.它主要通过抑制内皮细胞增生、迁移,并诱导内皮细胞凋亡、细胞周期停止而发挥作用,也可减少血管渗漏,具有很强的抑制活性.K5生物活性高,特异性强,相对分子质量小,性质稳定,不良反应轻,在眼科领域显示良好的应用前景.就K5的药理特性及其在眼科的应用做一综述.
