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白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析
根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库,并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.将扩增产物进行T-A克隆及测序.结果显示:分别以Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ消化的DNA库为模板而获得4个长短不一的DNA序列:806bp、2 190bp、3 076bp和2 206bp,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′-非翻译区序列及氨基端开头10个氨基酸的编码序列;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和/或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件.表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因4个上游启动子区序列,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P450基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用.
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基因步移在分离蚊虫细胞色素P450启动子中的应用及意义
[目的]快速扩增出白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP 6N3基因(CYP6N3)上游启动子区序列.[方法]根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5＇-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库(DL1、DL2、DL3及DL4),并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.[结果]第1步PCR结果显示:在上述4种消化文库中分别扩增出约806、2190、2 206和3 076bp的特异条带;第2步PCR结果与第1次PCR相类似,但各泳道主带扩增效率明显升高.[结论]本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3上游启动子区核苷酸序列及其4种限制性内切酶图谱.此外还对基因步移法在昆虫细胞色素P450多样性及其参与杀虫剂抗性分子机理研究中的意义进行了讨论.
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蚊虫细胞色素P450基因系列研究
报告中山医科大学寄生虫学教研室医学昆虫学室近5年来有关蚊虫细胞色素P450基因(CYP450)系列研究结果,包括:①通过简并引物PCR分别从致倦库蚊、白纹伊蚊及中华按蚊中获得3个、2个、2个CYP4家族成员基因片段;通过简并引物PCR及RT-PCR从白纹伊蚊中获得16个CYP6家族成员基因片段;②利用cDNA末端快速扩增(RACE)法获得了白纹伊蚊CYP6家族3个新的全长cDNA序列及7个超过其全长一半以上的cDNA序列.GenBankaccessionnumber分别为AF283836-AF283838(全长cDNA序列)和AF284782-AF284783(非全长cDNA序列),被国际P450命名委员会正式命名为CYP6N3v1-v3(全长cDNA序列)和CYP 6N3v4、CYP6N4v1-v6,并证实这些新基因同时存在于白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株及敏感株中;③运用基因步移方法从白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株中扩增出CYP6N3上游3 076 bp调控序列;④对白纹伊蚊CYP 6N3、CYP6N4非翻译区序列功能分析显示:昆虫CYP450与其它真核mRNA翻译起始及终止机制相似,但具有多态性的特点;⑤对白纹伊蚊CYP6N3上游启动子区序列特征与功能分析显示:蚊虫中CYP450转录起始存在着复杂性;⑥证实蚊虫中CYP6存在多样性,并分析讨论了此种多样性形成的可能机制;⑦分析讨论了蚊虫细胞色素P450 CYP6家族分子进化机制;⑧阐明了下一步研究的目标.
