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白纹伊蚊CYP6N3基因启动子序列的分子克隆与功能分析
根据本室已获得的白纹伊蚊CYP6N亚家族新成员CYP6N3全长cDNA的5′-末端核苷酸序列,设计2个反向特异引物(GSP1和GSP2),利用4种限制性内切酶Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ分别消化白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株高分子量基因组DNA,消化产物与适配子连接产生4种消化的DNA库,并分别以此为模板,进行基因步移.用特异引物GSP1与适配子引物AP1进行第1步PCR扩增,然后再以第1步PCR产物为模板、用内部特异引物GSP2与内部适配子引物AP2进行第2次PCR扩增.将扩增产物进行T-A克隆及测序.结果显示:分别以Dra Ⅰ、EcoR Ⅴ、Pvu Ⅱ和Stu Ⅰ消化的DNA库为模板而获得4个长短不一的DNA序列:806bp、2 190bp、3 076bp和2 206bp,它们均包括有CYP6N3全长cDNA5′-非翻译区序列及氨基端开头10个氨基酸的编码序列;在其ATG上游序列中均存在有若干个典型的TATA盒、Barbie盒和/或CCAAT盒、抗氧化剂反应元件或外源化合物反应元件.表明本实验已成功地获得了白纹伊蚊溴氰菊酯抗性株CYP6N3基因4个上游启动子区序列,并分析、讨论了它们在蚊虫中细胞色素P450基因多样性及其参与杀虫剂抗性中的作用.
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白纹伊蚊细胞色素P450CYP6N3基因的原核表达及鉴定
目的对白纹伊蚊细胞色素P450 CYP6N3基因进行原核表达,以获得高效表达蛋白.方法根据CYP6N3基因的全长cRNA为模板进行RT-PCR.产物经T-A克隆测序鉴定后,亚克隆入原核融合表达载体pGEX-4T-1(含有编码26KDa GST的基因序列)中,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行原核表达.将细菌总蛋白进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,通过Western blot分析鉴定目的蛋白的位置,并运用核酸蛋白分析仪扫描凝胶以确定表达产物的含量.结果获得了高效表达的融合蛋白GST-CYP6N3,表达量占菌体总蛋白的37.49%.结论本实验成功地异源表达了白纹伊蚊CYP6N3基因,为体外重建细胞色素P450 CYP6N3单加氧酶系,了解CYP6N3基因结构功能关系奠定基础.
