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H5亚型禽流感病毒现场实时荧光RT-LAMP检测方法点的建立与优化
H5亚型禽流感是重要的人兽共患病,建立现场快速分子学检测方法是其防控关键.本实验首次借助热裂解法抽提病毒RNA,建立H5亚型禽流感病毒(H5 subtype avian influenza Virus,AIV-H5)实时荧光反转录环介导等温扩增(Fluorescent quantitative real-time reversetranscription-LAMP,qRT-LAMP)检测法,并对该法进行特异性、敏感性、可重复性及可靠性分析；同时对比钙黄绿素(Calcein)、SYBR Green Ⅰ、羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol blue,HNB)、SYTO 81四种荧光染色剂在颜色判定中的工作情况,筛选佳染料.试验结果显示本实验所建AIV-H5qRT-LAMP法可有效鉴别AIV-H5,其敏感性较国家标准实时荧光RT-PCR检测法高100倍,低检测限可达1个基因拷贝；该法与IBV、NDV等常见禽呼吸道传染病病原无交叉反应,特异性强；同时该法具有良好重复性.本实验筛选出佳染色剂Calcein.小规模田间试验显示该法用于AIV-H5的普查监测结果可靠.可见本实验建立AIV-H5 qRT-LAMP检测法可满足AIV-H5现场快速分子检测需求,具广阔应用空间.
关键词： H5亚型禽流感 实时荧光反转录环介导等温扩增 现场检测 -
鸡IL-2、IL-1 8、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用
目的 探讨鸡IL-2、IL-18、IFN-γ cDNA和CpG DNA在减毒沙门菌运送H5亚型禽流感DNA疫苗中的佐剂作用.方法 将携带禽流感病毒(AIV)DNA疫苗的重组沙门菌SL7207(pVAX1-HA-IL2)、SL7207(pVAX1-HA-IL18)、SL7207(pVAX1-HA-IFN-γ)、SL7207(pVAX1-HA-CpG)、SL7207(pVAX1-HA)和SL7207(pVAX1)经口服和滴鼻途径首免1日龄商品代伊莎褐蛋鸡,测定免疫鸡的体液和黏膜免疫应答水平,并进行攻毒保护试验.结果 二免后3周,SL7207(pVAX1-HA-CpG)、SL7207(pVAX1-HA-IFN-γ)免疫组以及SL7207(pVAX1-HA)和SL7207(pVAX1-IFN-γ)联合免疫组鸡产生了较高水平的特异性黏膜免疫应答(P＜0.05),但重组菌免疫鸡血清中抗AIV HI抗体水平与空载体组相比差异无统计学意义.SL7207(pVAX1-HA-CpG)、SL7207(pVAX1-HA-IFN-γ)的免疫保护指数显著高于阴性对照组.结论 初步观察佐剂效应依次为:CpG＞IFN-γ＞IL-18,IL-2未表现出佐剂效应.
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基于鞭毛蛋白的H5亚型禽流感疫苗候选株的构建及鉴定
目的 构建基于鞭毛蛋白的H5亚型禽流感疫苗候选株.方法 以H5N1禽流感病毒血凝素(HA)基因和鼠伤寒沙门菌SL7202基因组为模板,通过重叠PCR扩增出HA1-2-fljB基因片段,将其插入原核表达载体pET32a(+),构建重组质粒pET32a-HA1-2-fljB,再将其转化表达菌E.coli BL21 (DE3),IPTG诱导目的蛋白表达.SDS-PAGE和Western blot法鉴定分析融合蛋白HA1-2-fljB.通过刺激HEK293-TLR5细胞,检测融合蛋白的TLR5生物学活性.结果 正确构建出重组质粒pET32a-HA1-2-fljB,SDS-PAGE显示,融合蛋白HA1-2-fljB相对分子质量(Mr)约为100 000,Western blot法表明融合蛋白具有良好的免疫反应性.TLR5生物活性实验结果显示,与HA1-2蛋白刺激组相比,HA1-2-fljB诱导HEK293-TLR5细胞分泌了高水平的IL-8(P＜0.01).结论 成功表达出具有TLR5活性的融合蛋白HA1-2-fljB,为研究H5亚型禽流感新型疫苗奠定了基础.
