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一种基于连续PMCA的PrPSc体外扩增方法的建立
为建立一种基于蛋白质错误折叠循环扩增(PMCA)的体外稳定扩增方法以观察PrPSc是否能在体外连续传代,我们分别制备了正常仓鼠和羊瘙痒病因子263K感染的发病仓鼠的全脑匀浆,将两种脑匀浆以不同体积比混合后,分别进行144个循环的直接PMCA和每轮48个循环、共8轮的连续PMCA,用Western blot对PrPSc的扩增情况进行检测.结果显示,与常规的直接PMCA方法相比,连续PMCA能更有效地使低浓度的PrPSc扩增到可检出的水平,表明连续PMCA可以支持羊瘙痒因子263K在体外长期稳定的复制.连续PMCA方法是一种体外高效地扩增PrPSc的方法,有潜力成为一种Prion体外培养方法,用于研究Prion错误折叠和复制机制,以及检测脑组织、外周组织和体液样品中的微量PrPSc.
关键词： Prion病 PrPSc PrPC 蛋白质错误折叠循环扩增 -
羊瘙痒因子263K感染仓鼠临床终末期脑中αB-晶体蛋白表达的研究
αB-晶体蛋白(αB-crystallin)是小热休克蛋白(Small heat shock protein,sHSP)家族的代表成员,已发现与多种神经退行性疾病发生发展密切相关,但至今为止对αB-晶体蛋白在朊病毒病发生发展中可能扮演的角色研究甚少,作用尚不清楚.本研究利用羊瘙痒因子仓鼠敏感株263K感染仓鼠建立的朊病毒实验动物模型,通过免疫印迹(Western blots)和免疫组织化学染色观察到伴随PrPSc在感染终末期动物脑组织中大量沉积,αB-晶体蛋白表达显著上调,比正常对照增高3倍.免疫荧光双染确定其分布的主要细胞类型为星形胶质细胞,神经元中未检测到表达.感染动物中高表达的αB-晶体蛋白与异常沉积的PrPSc无明显共定位.此研究为进一步探讨和揭示αB-晶体蛋白在朊病毒病中可能的作用和分子机制奠定了基础.
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羊瘙痒因子263K感染仓鼠终末期脑中胶质纤维酸性蛋白和神经元特异性烯醇化酶的表达和分布变化研究
为了探讨羊瘙痒因子263K感染仓鼠脑组织中星形胶质细胞和神经元的数量及功能改变,利用免疫印迹、免疫组化方法研究了胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)在受染仓鼠各脑区中表达变化的特点,同时比较其与神经病理学改变及PrPSc沉积的关系.结果表明,感染终末期仓鼠的脑组织中GFAP表达量明显增高,与正常对照相比,大脑皮质、脑干和小脑区域GFAP着色细胞数量分别增高3.69、2.41和1.56倍.感染仓鼠脑组织NSE表达量低于正常对照,小脑、海马CA1区和大脑皮质NSE着色细胞数量分别仅为正常对照相应区域的22.5%、54.2%和53.9%.这些变化与PrPSc在脑组织中的沉积程度和空泡样变性程度相吻合.结果提示,GFAP和NSE的检测可分别很好地反映星形胶质细胞和神经元的数量及功能状态,成为在朊病毒病发病过程中重要的病理变化指标.
关键词： 朊病毒病 胶质纤维酸性蛋白 神经元特异性烯醇化酶 PrPSc -
羊瘙痒病263K毒株感染的仓鼠脑中PrP分子形式多样性的动态测定
正常细胞的朊蛋白(PrPC)代谢和构象的改变是引发动物和人类可传播性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathies,TSEs)的根本原因.将羊瘙痒病( scrapie)仓鼠适应株263K颅内接种仓鼠, 在接种后的第20、40、50、60、70、80天, 通过Western blot 动态检测仓鼠脑中PrP存在的形式.结果在接种后第40天, 在感染动物脑组织中即检测到 PrPSc分子,比临床症状出现的时间早(平均潜伏期为66.7±1.1天),且无糖基化形式的PrP分子所占百分比在接种后期增加明显.除了标准分子量大小(30kD～35kD)的 PrP分子外,在感染动物脑中存在着高分子量和低分子量形式的PrP分子 .定量分析显示,随着接种潜伏期的延长,不同形式PrP分子的含量也在增加,其中低分子量形式的PrP分子与临床症状的出现密切相关.蛋白去糖基化实验表明,在感染动物脑组织中,除了标准分子量大小的PrP蛋白外,还存在一条更小分子量的PrP条带,而正常动物脑组织仅存在标准大小的Pr P分子.低分子量形式的PrP分子具有与全长PrP分子相类似的糖基化模式.结果提示,scrapie 263K感染的仓鼠脑组织中存在不同分子形式的PrPSc,其PrP分子的代谢可能不同于正常动物.
关键词： 羊瘙痒病毒株263K PRP PrPSc 糖基化 -
Creutzfeldt-Jakob 病非侵入性诊断方法研究新进展
朊病毒是一种非常规意义上的传染性病原体，常导致致命性神经系统疾病，其中以 Creutzfeldt-Jakob病（CJD）为常见。CJD 属于一种罕见的神经系统退行性疾病，临床进展迅速，致死性达100％。此疾病有多种类型，其中以散发型为常见。目前此病的大挑战即临床诊断。到目前为止临床确诊的金标准仍为脑组织活检，但将其作为诊断金标准仍存在一定局限性。随着研究的逐步进展，亟需探讨新的非侵入性的检测（手段），以利于疾病诊断。本文就有关 CJD 生物标记物检测、基因筛查、影像学检查及电生理检查等非侵入性手段的研究进展进行综述，旨在协助 CJD 的诊断，为 CJD 的确诊提供新的思路。
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朊病毒感染途径的研究进展
朊病毒病是一类能够感染人和其他动物的神经退行性传染病,其致死率高达100％,到目前为止尚无有效的治疗方法,该疾病直接威胁着人和动物的生命安全及健康.目前普遍认为该病的致病因子是一种结构异常的朊蛋白( PrPSc),其主要入侵宿主的中枢神经系统,研究发现PrPSc主要通过消化系统、血液循环系统和外周神经系统途径进行复制并传播,然后进入中枢神经系统导致疾病发生.本文对PrPSc从外周组织器官入侵神经系统的途径进行综述,以理解朊病毒神经入侵的机制.
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克-雅病在输血医学中的研究现状
克-雅病(CJD)是由传播性海绵状脑病引起的不可治愈的致命性神经退行疾病.输血是否能传播克-雅病是目前研究的热点.本文就克-雅病的传播途径、感染物的检测、输血传播的危险及对策进行综述.
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羊瘙痒病小鼠适应株ME7可突破种属屏障颅内感染金黄地鼠
目的羊瘙痒病感染因子在哺乳动物种属间的传播认为受种属屏障的限制,研究羊瘙痒病小鼠适应株ME7在仓鼠中的发病特征.方法ME7毒株颅内接种至金黄地鼠,观测疾病发生的潜伏期、临床病程和主要症状;Western blot和电子显微镜动态观测脑组织中PrPSc和痒病相关纤维的出现和分子特征.结果与以往报道的金黄地鼠适应株263K和小鼠适应株139A不同,在接种后460～530d后,感染动物出现明显的症状,主要为消瘦、嗜睡、运动迟缓;感染动物脑组织中存在有羊瘙痒病相关纤维和PrP-res;羊瘙痒病相关纤维和PrP-res的出现明显早于临床发病;比较三种毒株在仓鼠和小鼠脑组织中出现的PrP-res发现虽然在电泳移动位置上无差异,但ME7和139A的无糖分子比例明显降低.结论小鼠适应株ME7可突破种属屏障感染金黄地鼠;不同毒株在潜伏期、主要临床症状和临床病程等方面有明显差异;PrP-res的形成不仅受接种毒株的影响,而且受宿主PrP分子特征的影响.
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羊瘙痒因子263K经多种途径感染仓鼠的脑外组织PrPSc分子和沉积特点研究
目的比较研究实验仓鼠经不同途径感染羊瘙痒病(Scrapie)毒株263K的终末期病鼠脑外组织内PrPSc分子和沉积特点.方法以Scrapie 263K毒株经颅内、腹腔、心内、肌肉注射及灌胃等途径接种金黄地鼠,在终末期取脑、脊髓、脾、肾、舌、肌肉、小肠回盲部和胃组织,用HE染色观察病理变化,免疫组化法检测PrPSc的组织沉积特点,Western blot检测PrPSc分子特征.结果五种感染方式均可引起动物发病,在脑和脊髓组织中观察到典型的病理改变;PrPSc免疫组化检测显示外周途径感染动物脊髓白质内有大量沿纤维走行的PrPSc沉积,灰质前后角内围绕空泡点状或网状沉积,而颅内感染主要在中央管附近和后角出现大量的点状PrPSc沉积;脾脏、肾、小肠回盲部、胃组织中均观察到点状PrPSc的沉积;WesternBlot检测发现不同感染途径动物脊髓提取物均出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带,与脑提取物中PrPSc电泳性状完全一致;外周组织仅在脾脏检测到抵抗蛋白酶消化的PrPSc,但与正常对照比较,各种组织中PrP的总量明显增高,同时呈现与中枢神经组织不同的PrP电泳特征.结论在TSE感染发病过程中,多种组织细胞成分可能参与了TSE感染因子的向中枢神经系统传递过程,PrP蛋白在中枢神经组织和其他外周组织细胞中的翻译后修饰及代谢可能存在着不同的途径.
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朊粒及其相关感染
朊粒(prion)又称朊毒体,是引起人和动物发生传染性海绵状脑病(transmissible spongiform encephalopathy,TSE)的病原体.近年来,与其相关的牛海绵状脑病(bovine spongiform encephalo pathy, BSE)在英国严重流行,且已证实BSE的病原因子可传染给人类而引起新变异型克-雅病,为世界各国高度关注.
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羊瘙痒因子263K经灌胃感染仓鼠动物模型的建立
目的胃肠感染是大多数动物类传染性海绵状脑病(TSE)传播的主要途径.建立羊瘙痒因子263K灌胃感染仓鼠动物模型,并研究其发病特征.方法 Scrapie 263K毒株低剂量和高剂量经灌胃途径接种金黄仓鼠,在终末期取脑组织,用HE染色观察病理变化,免疫组化法检测PrPSc的组织沉积特点,Western blot检测PrPSc分子特征.结果低剂量灌胃组仅一只动物发病,高剂量组所有接种动物均发病,潜伏期较颅内注射组明显延长.在脑组织中观察到典型的病理改变;PrPSc免疫组化检测显示弥漫性沉积于脑组织,主要累及脑干、大脑皮层深层、小脑,基本与病理学改变累及的区域一致;Western Blot检测发现感染动物脑提取物出现可抵抗蛋白酶消化的PrPSc条带,与颅内注射组脑组织提取物中PrPSc电泳性状完全一致.结论羊瘙痒因子263K灌胃可成功引起动物发病,与颅内注射比较,潜伏期、神经病理变化和PrPsc沉积均有不同,可能受到感染途径的影响.
