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热毒清对HL-60细胞产生分泌型肿瘤坏死因子α及肿瘤坏死因子α转换酶mRNA表达的影响
目的：探讨纯中药制剂热毒清抑制肿瘤坏死因子α(TNFα)失控释放的分子机制。方法：采用细胞和分子生物学技术观察热毒清对HL-60细胞分泌炎性细胞因子——分泌型肿瘤坏死因子α(sTNFα)及肿瘤坏死因子α转换酶(TACE)mRNA表达的影响。结果：(1)1∶30稀释的热毒清能有效地控制内毒素脂多糖(LPS)刺激所引起的sTNFα的高分泌。(2)热毒清单独作用HL-60细胞时，对TACE mRNA的表达虽无明显的抑制作用，但对LPS刺激增加表达的TACE mRNA具有明显的抑制效果。结论：热毒清对LPS引起的炎性细胞因子sTNFα的分泌及对sTNFα激活的关键酶——TACE的基因表达具有双重抑制作用，提示热毒清可能是一种TACE良好的天然抑制剂。
关键词： 热毒清 HL-60细胞 肿瘤坏死因子α转换酶 基因表达 -
重组TACE前肽对自身TACE活性的抑制作用
目的 以脂多糖(LPS)刺激人单核细胞型淋巴瘤细胞株THP-1为模型,观察重组肿瘤坏死因子α转换酶(TACE)前肽结构域对催化TACE结构域的自身抑制作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段.方法 首先利用DNA重组技术分别构造含前肽结构域和催化结构域的重组载体:用PCR方法 扩增出TACE的胞外结构域(T1300)和前肽结构域(T591),并克隆至载体pET-28a(+)中,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的 蛋白,两者均为包涵体,变性复活后经Ni2+-NTA亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化.对纯化后的蛋白进行Western blot分析.LPS分时相刺激THP-1细胞后,用细胞学技术观察纯化的T591在蛋白质水平上对TACE的表达和活性的影响.结果 TACE重组前肽蛋白能显著抑制TACE的活性,减少分泌型TNF-α(sTNF-α)分泌,抑制率达57%.结论 TACE重组前肽抑制了TACE的活性,降低了sTNF-α的分泌,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法 .
关键词： 肿瘤坏死因子α 肿瘤坏死因子α转换酶 前肽结构域 抑制剂 -
三类TACE抑制剂的作用机理探讨
目的:以脂多糖(LPS)刺激的HL-60细胞系为天然模型,筛选肿瘤坏死因子α转换酶的抑制剂,为人工干预炎症过程提供依据和手段.方法:分时相刺激HL-60细胞后,用分子生物学和细胞学技术在蛋白质和mRNA水平上研究TACE表达和活性的改变.结果:中药热毒清(RDQ)能明显降低LPS诱导的TACE mRNA增加(与对照组比,P＜0.01);针对TACE mRNA的反义寡核苷酸(anti-ODN)在翻译水平上抑制TACE表达,抑制率达78.9%;化学合成的针对TACE催化域的小分子底物模拟肽可抑制LPS诱导的TACE表达增加,从而抑制sTNFα分泌增加,削弱LPS诱发的炎性病理反应强度.结论:3种不同类型的抑制(RDQ、anti-ODN、底物模拟肽)在不同层次上调节TACE的表达,终均抑制了sTNFα的分泌,为控制炎症提供了明确的治疗靶标.
关键词： 肿瘤坏死因子α 肿瘤坏死因子α转换酶 反义寡核苷酸 热毒清 小分子类肽抑制剂 -
TACE在自体髓核移植背根节致根性神经痛中的作用机制研究
目的:探讨TACE在椎间盘突出致坐骨神经痛发病机制中的作用.方法:采用自体髓核移植至L45,神经节,建立根性神经痛的动物模型.应用Von Frey针丝及RTY-I型热痛测仪对神经行为的改变进行检测,采用免疫组化法检测TACE在神经节及神经根中的表达,采用RT-PCR的方法检测TACE和TNF-amRNA表达,并分析其与神经行为改变之间的相关性.结果:自体髓核移植可以导致明显的机械刺激痛觉过敏现象,而无明显的热刺激痛觉过敏,TACE在自体髓核移植术后4 d表达开始增强(P<0.05),术后1周表达强(P<0.01),术后3周逐渐恢复正常,与TNF-α的表达及TACE的表达之间存在显著相关性.结论:TACE作为释放活性TNF-a的特异性蛋白酶,自体髓核移植至DRG后,其蛋白表达升高,TNF-amRNA、TACEmRNA表达之间存在线性相关,说明TACE可能是抗TNF-α治疗的新靶点,在治疗椎间盘突出引起的根性神经痛中具有重要作用.
关键词： 髓核 坐骨神经痛 TNF-α 肿瘤坏死因子α转换酶 神经节 -
重组TACE前肽蛋白对小鼠内毒素血症抑制作用的实验研究
目的 建立小鼠内毒素血症模型,观察肿瘤坏死因子前体转换酶(TACE)前肽结构域对其催化结构域的自身抑制作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段.方法 首先利用DNA重组技术分别构建含前肽结构域和催化结构域的重组载体:用PCR方法扩增出TACE的胞外结构域(T1300)和前肽结构域(T391),并克隆至载体pET-28a(+)中,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的 蛋白,两者均为包涵体,变性复活后经Ni2+-NTA亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化.对纯化后的蛋白进行Western印迹分析.构建TACE信号肽+前肽结构域(T648)的真核表达质粒(pEGFP-N1/T648),将其瞬时转染HeLa细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达观察pEGFP-N1/T648转染后在细胞中分布情况.建立小鼠内毒素血症模型组,前肽重组蛋白治疗组和PRS对照组,通过流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞mTNF-a的表达,并取肝,肺,肾组织行HE染色,观察纯化的前肽蛋白对炎症的抑制作用.结果 成功构建了pEGFP-N1/T648真核表达载体,在体外转染HeLa细胞,可见荧光主要分布在细胞膜上.流式细胞技术证明重组前肽蛋白可明显对抗LPS诱发的sTNF-a分泌增加,使小鼠腹腔巨噬细胞膜表面mTNF-a增加,常规病理切片HE染色显示该蛋白可降低LPS诱发的小鼠肝,肾,肺组织的炎症反应.结论 TACE前肽重组蛋白降低了sTNF-a的分泌,对炎症有明显的抑制作用,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法.
关键词： 肿瘤坏死因子α 肿瘤坏死因子α转换酶 前肽结构域 抑制剂 -
跨膜肿瘤坏死因子α转换酶与肿瘤坏死因子-α相互关系及抑制调控的研究
象大多数解整连蛋白-金属蛋白酶(a disintegrin and metalloprotease,ADAMS),肿瘤坏死因子α转换酶(tumor necrosis factor-αconverting enzyme,TACE)是一种多结构域的Ⅰ型跨膜蛋白,具有显著的金属蛋白酶水解活性.其主要功能是将膜结合型肿瘤坏死因子α(mTNF-α)前体水解,产生具有生物活性的可溶性TNF-α(sTNF-α),而对TACE这一在胞外脱落机制还不十分清楚,其在生物体内调节方式及各结构域的相互作用还有待进一步研究.而TACE C末端区域能否结合信号分子及其位点如何,对研究其结构和与其结合的蛋白质的信号转导以及转换的机制将有着重要的意义.找出其在胞膜外脱落的原因,是否与C末端结合的膜蛋白或蛋白水解酶有关,这已成为研究的热点.C末端尾部(694～824)为胞浆内段,包含一个潜在的磷酸化位点和一个结合同源物3区(Src homology 3 domain,SH3)的位点,有趣的是TACE胞内区很可能具有信号转导的功能.本文就近年来TACE在其生物学结构、特性和与疾病关系方面的研究进行综述.
关键词： 肿瘤坏死因子α转换酶 肿瘤坏死因子α 跨膜蛋白 基质金属蛋白酶 膜结合型
