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MRSA的苯唑西林、头孢西丁MIC与PBP2a的相关性研究
金黄色葡萄球菌是人类重要致病菌.随着耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的分离率不断增加,快速、准确检测MRSA对选用合适的抗生素治疗具有重要意义[1].现已证实耐甲氧西林葡萄球菌(MRS)的主要耐药机制是由于MRS含有的mecA基因表达了青霉素结合蛋白2a(PBP2a),因此,美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)推荐无论是检出mecA基因还是PBP2a均可报告MRS[2].本实验应用MRSA胶乳试剂盒(日本Deka-Seiken公司)和肉汤稀释法分别检测102株金黄色葡萄球菌的PBP2a、头孢西丁低抑菌浓度(MIC)和苯唑西林MIC,以了解其相关性,结果报道如下.
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凝固酶阴性葡萄球菌的青霉素结合蛋白产生和苯唑西林MIC相关性研究
目的分析凝固酶阴性葡萄球菌(CNS)的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)的产生和苯唑西林MIC相关性. 方法收集82株临床分离株,采用MRSA胶乳凝集法、MIC法分别检测CNS对苯唑西林的耐药性,比较各试验结果. 结果苯唑西林MIC≥0.5 mg/L或产生PBP2a的表皮葡萄球菌和溶血葡萄球菌均能正确地表示苯唑西林耐药;苯唑西林MIC≥0.5 mg/L解释标准对头葡萄球菌、腐生葡萄球菌、人葡萄球菌、模仿葡萄球菌等CNS评价苯唑西林为耐药,正确性很低,有80.0%未产生PBP2a的菌苯唑西林MIC≥0.5 mg/L,使这些菌被错误地报道苯唑西林耐药. 结论新的苯唑西林解释标准对产生PBP2a的CNS均能正确地评价,而对未产生PBP2a的CNS某些菌种缺乏特异性;MRSA胶乳凝集试剂盒可快速、准确地检测耐苯唑西林的CNS.
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单克隆抗体标志乳胶凝集试验快速检测金黄色葡萄球菌及其耐药性
目的探讨金黄色葡萄球菌(SAU)的细菌学快速检测鉴定及其耐药性分析的试验方法.方法目标菌落先经传统鉴别方法怀疑葡萄球菌,采用Slidex MRSA Detection乳胶快速检测SAU菌株青霉素结合蛋白2a(PBP2a),确认耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA);设立SAU耐苯唑西林筛选试验对照,两组不符合菌株经PCR方法检测MceA基因确认.结果456株葡萄球菌中Slidex staph.plus乳胶凝集法阳性(鉴定为SAU)135株,135株凝集法阳性菌中后确认为SAU 127株,321株凝集法阴性菌后确认为SAU11株,乳胶凝集法鉴定金黄色葡萄球菌灵敏度92.0%,特异性97.5%;Slidex MRSA Detection乳胶快速检测138株SA的PBP2a,阳性52株,138株SAU经苯唑西林筛选试验及PCR测定mceA基因,确定MRSA57株,乳胶凝集法快速检测SAU的PBP2a确定MRSA,灵敏度91.2%,特异性100%.结论单克隆抗体乳胶凝集法快速检测SAU及鉴定MRSA,具有较高灵敏度和特异性.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌异质性耐药株检测方法探讨
目的 探讨耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的异质性耐药株的检测方法.方法 收集102株金黄色葡萄球菌,采用微量肉汤稀释法分别检测其对头孢西丁、苯唑西林的耐药性,乳胶凝集法检测青霉素结合蛋白2a(PBP2a),同时采用菌群谱分析法对异质性耐药株进行筛选.结果 头孢西丁耐药71例(69.6%),其中PBP2a阳性70例(98.6%);苯唑西林耐药80例(78.4%),其中PBP2a阳性70例(87.5%).头孢西丁耐药菌株PBP2a检出率明显高于苯唑西林(P<0.05).苯唑西林耐药而头孢西丁敏感的9株菌中筛选出2株(22.2%)异质性耐药株.结论 头孢西丁检出MRSA的敏感性优于苯唑西林,但苯唑西林对MRSA异质性耐药菌株检测的敏感性优于头孢西丁.
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耐甲氧西林葡萄球菌PBP2a的质粒克隆与构建
目的 克隆并构建耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)青霉素结合蛋白2a(PBP2a)全长及转肽酶区的原核表达质粒.方法 登录基因文库查找获得mecA基因的编码序列,应用PCR技术扩增获得DNA片段,将此基因片段插入PET-32a载体,同时酶切鉴定阳性克隆,DNA序列测定验证序列正确性.结果 PCR扩增获得了mecA基因全长及转肽酶区DNA片段,成功插入到原核表达载体PET32a,双酶切鉴定及DNA序列测定证实插入片段正确.结论 成功构建了PBP2a全长及转肽酶区片段表达质粒,为该蛋白的纯化表达和疫苗研究奠定了基础.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 青霉素结合蛋白2a 转肽酶区 mecA基因 -
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的原核表达及其纯化
目的 原核表达耐甲氧两林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)青霉素结合蛋白2a(penicillin binding protein 2a,PBP2a)转肽酶区,并进行纯化及鉴定.方法 PCR扩增编码PBP2a转肽酶区的me cAf基因片段,克隆至原核表达载体pGEX-6p-1中,构建重组表达质粒pGEX-6p-mecAf,经双酶切(BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ)及测序鉴定正确后,转化感受态大肠埃希菌(E.coli)BL21进行诱导表达;经蛋白亲和层析柱纯化后,进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组表达质粒pGEX-6p-mecAf经双酶切(BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ)及测序鉴定证明构建正确;表达产物的相对分子质量约63 000,表达量约占菌体总蛋白的14.5％,纯化后纯度达90％.结论 成功构建了PBP2a转肽酶区的原核表达质粒,目的蛋白在E.coii中获得高效表达,为制备单克隆抗体及建立MRSA快速检测方法奠定了基础.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 青霉素结合蛋白2a 转肽酶区 原核细胞 基因表达 -
青霉素结合蛋白2a胶乳凝集试验快速检测耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌
耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(Methicillin resistant coagulase-negative Staphylococcus,MRCoNS)是医院感染的重要病原菌,青霉素等β-内酰胺类抗生素对之临床无效.MRCoNS耐β-内酰胺类抗生素的主要机制是产生低亲和力的新型青霉素结合蛋白PBP2a,该蛋白由mecA基因编码.本文对PBP2a筛选法[1]与PCR检测mecA基因的方法进行比较,评价其可靠性和临床应用价值,以寻找适合医院实验室检测MRCoNS的简单而可靠的方法.
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单克隆抗体标志乳胶凝集试验快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌
目的探讨快速检测耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的实验方法. 方法目标菌株采用Slidex MRSA Detection 乳胶快速检测金黄色葡萄球菌(SA)菌株青霉素结合蛋白2a(PBP2a),确认MRSA;设立SA耐苯唑西林筛选试验对照,两组不符合菌株经PCR方法检测MecA基因确认. 结果 Slidex MRSA Detection 乳胶快速检测247株SA的PBP2a,阳性93株(37.65%);247株SA经苯唑西林筛选试验及PCR测定MecA基因确定MRSA102株(41.30%),93株PBP2a阳性菌株都为MRSA;PBP2a阴性耐苯唑西林22株中,经PCR法检测MceA基因,9株确认为MRSA,13株为甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌(MSSA).乳胶凝集法快速检测SA的PBP2a确定MRSA,敏感性91.2%,特异性100%,阳性预测值为1,阴性预测值0.94. 结论单克隆抗体乳胶凝集法快速检测鉴定MRSA具有较高敏感性和特异性.
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耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a转肽酶区的克隆、表达及纯化鉴定
目的：构建编码耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）青霉素结合蛋白2a （PBP2a）转肽酶区基因片段的原核表达载体，并表达、纯化及鉴定蛋白。方法从临床标本中分离鉴定M RSA ，设计针对编码 PBP2a转肽酶区基因片段的引物，采用聚合酶链式反应（PCR）扩增目的基因片段，克隆至pET28a（＋）载体，双酶切鉴定并测序，转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS株；用0．7 mmol／L异丙基硫代‐β‐D‐半乳糖苷（IPTG）诱导表达后，利用Ni亲和层析技术纯化目的蛋白；蛋白免疫印迹法（WB）鉴定重组蛋白。结果重组表达载体经BamHⅠ、EcoRⅠ酶切，产物在预期大小处出现条带，测序结果显示有两个碱基突变，无移码突变。所表达的PBP2a蛋白经十二烷基硫酸钠‐聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS‐PAGE）和WB鉴定，在相对分子质量38×103处可见一新生蛋白条带。结论成功构建了PBP2a转肽酶区原核表达载体，并获得了高效表达，制备了高纯度的目的蛋白。
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 mecA基因 青霉素结合蛋白2a 转肽酶区 -
PBP2a的分子生物学特性及其临床应用研究进展
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌是医院感染的重要病原菌之一,对常用的包括甲氧西林在内的多种抗生素广泛耐药,其主要耐药机制是mecA基因编码低亲和力的青霉素结合蛋白2a(PBP2a)蛋白所致.现就PBP2a的分子生物学特性及其在临床诊断和防治等临床应用方面的研究进展作一综述.
关键词： 青霉素结合蛋白2a 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 mecA基因 -
抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用
目的: 制备和鉴定抗MRSA-PBP2a转肽酶区蛋白单克隆抗体(mAb), 初步建立检测PBP2a的乳胶凝集方法.方法: 以基因工程重组PBP2a转肽酶区蛋白为抗原, 免疫BALB/c小鼠, 制备鼠源性mAb, 间接ELISA鉴定IgG亚类、腹水效价及亲和常数, Western blot检测mAb的特异性, 用所得mAb致敏聚苯乙烯乳胶, 建立检测PBP2a的乳胶凝集方法.结果: 筛选出2 株能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株F1和F2, 免疫球蛋白亚类均为IgG1类; 腹水效价为0.5×106 ～1×106, 亲和力常数分别为1.57×108 M-1和5.43×109 M-1.Western blot显示F1、F2抗体均能有效识别重组PBP2a转肽酶区蛋白及MRSA临床分离株中的天然PBP2a, 用 mAb F2建立了乳胶凝集法, 敏感性达1 mg/L.结论: 获得2株特异性好、亲和力高、能稳定分泌抗PBP2a mAb的杂交瘤细胞株, 为研制MRSA快速鉴定试剂盒奠定了良好的基础.
关键词： 耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌 青霉素结合蛋白2a 单克隆抗体 乳胶凝集法 -
耐甲氧西林金黄色葡萄球菌PBP2a的真核表达及其在抗体鉴定中的应用
目的 利用杆状病毒表达系统表达耐甲氧西林金黄色葡萄球菌青霉素结合蛋白2a(PBP2a).方法 用EcoR I和BamHⅠ双酶切pGEMT-mecA重组质粒DNA,回收目的 基因mecA,与pFastBac1质粒连接转化入含有穿梭载体bacmid的大肠埃希菌DH10Bac中,筛选重组穿梭载体Bacmid-mecA并转染Sf9细胞,获取完整的重组杆状病毒.用免疫荧光(IFA),Western blot法进行蛋白鉴定.结果 成功地获得含mecA基因的重组杆状病毒.杆状病毒感染Sf9细胞形态变化明显,能够表达出与PBP2a多克隆抗体相结合的蛋白.结论 利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功地表达了PBP2a蛋白.
关键词： 耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 青霉素结合蛋白2a 真核表达 -
青霉素结合蛋白2a单克隆抗体的研制和初步应用
目的 研制青霉素结合蛋白2a(PBP2a)单克隆抗体(McAb),为建立耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)免疫层析检测方法提供检测用抗体.方法 以基因工程抗原rPBP2a免疫BALb/c小鼠,通过常规小鼠B淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,采用免疫印迹技术(Western blotting)分析单克隆抗体特异性.选取敏感、特异的单克隆抗体进行金标记和硝酸纤维膜包被,建立胶体金免疫层析检测方法.结果 共获得11株分泌抗rPBP2a的杂交瘤细胞,其中6株分泌的单克隆抗体能够与天然PBP2a呈阳性反应.用其中2株单克隆抗体建立的PBP2a胶体金免疫层析方法,可在5～ 20 min内完成检测.结论 获得了特异性针对PBP2a蛋白的单克隆抗体,并初步建立了检测PBP2a蛋白的胶体金免疫层析检测方法,为临床快速、简便检测产生PBP2a的细菌提供了检测方法.
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青霉素结合蛋白2a C-末端在大肠杆菌M15中的表达、纯化及鉴定
目的 构建含目的基因mecA C末端的重组子并在大肠杆菌M15中进行蛋白表达.方法 采用PCR方法扩增mecA C末端DNA,将其与表达载体pQE30连接;再通过PCR及双酶切鉴定连接产物.将含目的基因片段的阳性重组质粒转化大肠杆菌M15后,用1mmol/L的IPTG进行诱导表达.应用Ni-NTA琼脂糖进行亲和层析纯化目的蛋白,并用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行鉴定.结果 成功构建pQE30-mecA重组表达质粒,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,亲和层析纯化获得分子量为39.7 kDa的蛋白;Westem blotting和肽指纹图谱证实该蛋白为带有多聚组氨酸标签的融合蛋白.结论 在大肠杆菌内成功表达具有活性的PBP2a,为后期研究和开发抗MRSA药物奠定了基础.
