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APOBEC3G抗HIV-1的分子机制及Vif基因对其拮抗作用研究进展
近30年,艾滋病的高致病率和高死亡率一直被医学界高度关注,期望通过中医药研究在艾滋病防治上寻求突破,从而引发了中医药研究与分子生物学研究交叉与结合.由于近10年HIV的分子生物学研究文献,发现HIV的辅助蛋白vif和APOBEC3G为当前艾滋病致病机制研究的热点.本文对HIV的辅助蛋白vif的生物学特性、APOBEC3G抗HIV-1的分子机制及vif与APOBEC3G相互作用的新近研究成果进行整理分析,探讨基于此进行HIV基因治疗的意义以及中医药治疗HIV可能的研究方向.
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靶向HIV-1 vif的高效人工miRNA的构建及慢病毒介导的体外抗病毒研究
RNAi在HIV-1的治疗研究中得到了广泛的应用,构建高效并且安全的RNAi抗病毒元件是开展相关研究的基础.vif37是以前的研究中筛选获得的靶向HIV-1 vif的高抑制效率兼具保守性的RNAi靶点.miRNA在抑制效率和启动子的选择上比常用的shRNA具有优势.本研究探索以人工miRNA结构引发vif37靶点对应的RNAi.本研究以天然的miR-155前体为骨架,采用步移的方式设计了3个靶向vif37的人工miRNA,以RNA聚合酶Ⅱ类启动子指导表达.miRNA表达质粒和HIV-1的感染性克隆pNL4-3共转染的结果显示,3个人工miRNA中只有miR-vif37H具有抑制效果,效率与shRNA-vif37相当.与携带靶序列的荧光索酶报告质粒共转染实验证明miR-vif37H具有良好的抑制特异性.用表达miR-vif37H的重组慢病毒转导HIV-1的敏感细胞MT-4,克隆化后获得稳定表达miR-vif37H的细胞株MT-4-miR37H,该细胞可以有效抑制HIV-1的体外复制.实时RT-PCR检测结果显示,与shRNA-vif37相比,miR-vif37H的表达水平明显下降,安全性更好.进一步的实时RT-PCR检测结果还显示,miR-vif37H在细胞内的稳定表达不会影响内源代表性miRNA(miR-181和miR-16)的加工以及干扰素应答相关基因Stat1的mRNA水平.miR-vif37H是一个特异的高效RNAi元件,为vif37靶点的进一步应用研究奠定了基础.
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靶向HIV-1 vif的高效siRNA的筛选及慢病毒介导的体外抗病毒研究
RNAi技术在艾滋病治疗研究中已展现出巨大的潜力,兼具高效抑制特性和保守性的siRNA靶位是其获得成功应用的重要基础.本研究选择以HIV-1 vif基因为靶区筛选高效保守的RNAi序列,共选择设计了30个识别不同位点的siRNA序列,以pSUPER为载体构建了相应的shRNA表达质粒.通过与pNL4-3质粒在293FT细胞中进行共转染抑制实验,以及对初筛获得的高效序列进行保守性分析显示siRNA-vif37序列具有高效抑制效率和较好的保守性特征.通过与pGL3-vif报告质粒的共转染实验证明siRNA-vif37具有vif基因抑制特异性.带有shRNA-vif37表达元件的重组慢病毒转导后的MT-4细胞在HIV-1NL4-3体外攻毒实验中可显示出较有效的抑制病毒复制的能力,本研究进一步对转导后细胞进行克隆化筛选,获得稳定整合shRNA-vif37表达元件的MT-4-vif37细胞克隆,该细胞具有显著的抑制病毒复制的能力,在高攻毒剂量下仍可获得良好的抑制效果.本研究为进一步应用RNAi技术进行新型艾滋病治疗方法研究提供了重要基础.
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HIV辅助蛋白拮抗细胞限制因子机制研究进展
抗病毒限制因子成为病毒学研究领域的热点.近些年陆续发现了4种HIV限制因子:APOBEC3G、Trim5α、Tetherin、SAMHD1.其中APOBEC3G、Tetherin、SAMHD1分别被HIV编码的辅助蛋白Vif、Vpu、Vpx所拮抗.这些辅助蛋白影响病毒的致病性和复制能力,拮抗宿主内的天然抗病毒限制因子,使病毒能够成功的侵染宿主细胞.本文重点综述了这三种能拮抗宿主限制因子的HIV辅助蛋白的功能研究进展.
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新型抗病毒因子APOBEC3G研究进展
APOBEC3G是一种天然抗病毒活性的胞嘧啶脱氨基酶家族成员,近年来因其独特的抗病毒作用机制受到了广泛的关注.在艾滋病病毒(HIV)复制过程中,APOBEC3G大量包装进入新生成的病毒颗粒内部,诱导病毒负链cDNA胞嘧啶(C)脱氨基突变为尿嘧啶(U),导致病毒丧失活性.而HIV编码的Vif蛋白能拮抗APOBEC3G的脱氨基酶作用,二者形成动态平衡.作为一种机体天然抗病毒因子,APOBEC3G参与了宿主抵抗HIV入侵的防御机制,为新型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研究开拓了新的方向,可能对未来的HIV及其他病毒性疾病的防治提供新的线索并产生重要的影响.
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HIV—1病毒感染因子Vif及其相关抑制剂的研究进展
HIV-1(human immunodeficiency virus type 1)病毒感染因子Vif(viral infectivity factor)是高度保守的碱性磷酸化蛋白质,是HIV-1的辅助调节蛋白之一.Vif蛋白的主要功能是能够介导宿主细胞体内载脂蛋白BmRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G (apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic polypeptide like 3G,APOBEC3G)的降解,从而增强病毒的感染性.此外,它还具有调节病毒的逆转录和复制晚期以及诱导细胞G2期停滞等功能.目前,许多实验室已经针对Vif蛋白进行抑制剂的设计.本文简要叙述了Vif蛋白的结构与功能,并主要对其抑制剂的新进展进行了综述.
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人类免疫缺陷病毒-1 Vif蛋白的表达及生物学功能
目的 分析上海HIV-1分离株病毒感染因子(Vif)蛋白编码基因突变特点,构建HIV-1vif基因原核表达质粒,并了解其免疫原性.方法 采用RT-PCR法扩增23例上海HIV-1分离株vif基因并测序,与HIV-1国际标准毒株比较;将vif编码基因克隆入原核表达载体pET32b(+),构建pET32b(+)-HIV-1/Vif重组质粒;将该质粒转化入细胞BL21D3(Star)表达,并纯化HIV-1 Vif蛋白,制备Vif蛋白鼠多克隆抗体,并以ELISA检测Vif蛋白及其鼠多克隆抗体的免疫原性.统计学处理采用t检验.结果 上海HIV-1分离株vif基因与国际标准毒株相比较,核苷酸突变率为(0.179±0.006)%,并具有多处相似的变异位点,上海HIV-1分离株Vif蛋白第151～240位氨基酸相对保守;成功构建HIV-1 vif基因原核表达质粒pET32b(+)-HIV-1/Vif,表达并纯化Vif蛋白,制备了Vif多克隆抗体;重组HIV-1 Vif蛋白与HIV感染者及健康人血清反应比较,差异无统计学意义(P＞0.05);鼠多克隆抗体与重组Vif蛋白反应与健康对照组血清比较差异有统计学意义(t=178.61,P<0.01).结论 上海HIV-1分离株vif基因与HIV-1国际标准毒株比较存在较高突变,成功地构建了HIV-1 vif基因原核表达载体pET32b(+)-HIV-1/Vif,制备了Vif多克隆抗体.
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含HIV-1 Vif基因重组慢病毒表达载体的构建及其对KSHV裂解性周期复制影响的初探
目的:利用慢病毒表达载体将HIV-1 Vif基因导入原发性渗出性淋巴瘤(PEL)细胞BCBL-1中使之持续表达目的蛋白Vif,并检测Vif对其中潜伏KSHV裂解性周期复制的影响.方法:白表达质粒pCI-neo-Vif中扩增出Vif基因,插入到pHAGECMV-MCS-IzsGreen中构建成慢病毒载体pHAGE-Vif,利用脂质体将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转染293T细胞.荧光显微镜观察293T细胞中绿色荧光蛋白(GrP)表达情况;收集培养上清经0.45μm滤器过滤后即获得病毒悬液.梯度稀释法测定病毒滴度,感染293T细胞,48 h或72 h后进行RT-PCR和Western blot检测Vif基因的转录和表达情况.以MOI为1.0的病毒量感染靶细胞BCBL-1,利用Western blot技术检测Vif蛋白的表达,同时检测KSHV vIL-6和Rta的蛋白表达水平,初步探讨Vif对KSHV复制的影响.结果:限制性内切酶检测和基因测序证实成功构建了携带Vif基因的慢病毒表达载体,滴度为4×10~7 efu/ml.以MOI为1.0的重组慢病毒感染靶细胞BCBL-172 h后,能够检测到外源基因Vif的蛋白表达.Western blot结果初步显示,Vif能够下调vIL-6和Rta的蛋白表达水平.结论:成功构建了含Vif基因的慢病毒表达载体,获得的病毒能够有效感染BCBL-1细胞,并在其中大量表达目的蛋白.初步结果提示,Vif能够下调vIL-6和Rta的蛋白表达水平.对KSHV裂解性周期复制可能起到抑制作用.
