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α-生育酚对亚硝胺诱导人食管上皮细胞癌变早期NFκB和Nrf2信号通路的调节作用
目的 研究α-生育酚(α-tocopherol,α-T)对亚硝胺诱导人食管上皮细胞癌变早期NFκB和Nrf2信号通路的调节作用.方法 采用N-甲基苄基亚硝胺(N-nitrosomethylbenzylamine,NMBzA)染毒人正常食管上皮细胞(HET-1A)模拟食管癌变启动,染毒浓度为50、100 μmol/L,染毒时间为24 h.α-T干预组细胞在染毒前3h加入25、50、100 μmol/L的α-T进行预处理,然后与100 μmol/L NMBzA共同孵育24 h;人食管鳞癌细胞(EC109)细胞采用相同浓度的α-T进行处理并与HET-1A进行对比;以体积分数为0.1％二甲基亚砜(DMSO)处理组细胞作为对照组.采用细胞免疫荧光试验分析NFκB p65和Nrf2在细胞内的分布和活化状态,采用RT-PCR或Western blot法检测细胞周期素D1 (cyclinD1)、核蛋白KI67(KI67)、增殖细胞核抗原(PCNA)、环氧化酶2(COX2)、5脂氧合酶(5LOX)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶(NQO1)、谷胺酸半胱氨酸连接酶(GCLC)等相关靶基因表达水平,采用流式细胞术检测细胞内活性氧水平.结果 HET-1A细胞经100 μmol/L NMBzA染毒后,CyclinD1、KI67、PCNA基因表达水平分别为2.99±0.15、2.35±0.38、2.46±0.25,均高于对照组(1.00±0.08)(F值分别为97.23、65.28、34.62,P值均＜0.001);与对照组(0)相比,NFκB p65 (71.0％,98/138)和Nrf2(36.3％,49/135)在细胞核内的分布比例增加(x2值分别为194.71、133.72,P值均＜0.001).与对照组(1.00±0.05)相比,HET-1A靶基因COX2 (3.22±0.17)、5LOX (2.87±0.12)和HO-1 (1.87±0.22)、NQO1 (2.14±0.08)、GCLC(2.63±0.41)蛋白表达水平均升高(F值分别为72.35、43.87、69.23、71.34、85.79,P值分别为0.013、0.015、0.010、0.011、0.002).50 μmol/Lα-T干预处理后,与100 μmol/L NMBzA组(71.0％,98/138)相比,NFκB p65在核内分布(7.7％,8/104)减少(x2=148.10,P＜0.001),其靶基因COX2 (0.74±0.19)、5LOX (0.42±0.13)蛋白表达水平降低(F值分别为56.31、73.25,P值分别为0.003、0.001);而Nrf2信号通路相关指标未出现改变(P值均＞0.05);α-T对EC109细胞中NFκB和Nrf2信号通路均无影响(P值均＞0.05).结论 在NMBzA诱发食管癌早期,α-T能够通过阻断NFκB信号通路的激活从而抑制癌变启动,可能是α-T对食管癌潜在预防作用的主要机制;食管癌发病过程中,细胞可能因Nrf2信号通路的激活而获得了适应氧化应激的能力.
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α-生育酚对脑皮层神经元线粒体的保护作用
目的 探讨α-生育酚对神经元线粒体的保护作用.方法 将神经元细胞进行分组,分为:(1)正常对照组,(2)单纯氧自由基损伤组,(3)α-生育酚保护组.利用Fenton反应造成神经元细胞氧自由基损伤,用激光共聚焦显微镜观察各组神经元JC-1染色结果 ,并检测各组神经元琥珀酸脱氢酶(SDH)和细胞色素氧化酶(CCO)活性.结果 (1)JC-1染色结果 分析:α-生育酚保护组神经元线粒体功能强于单纯氧自由基损伤组.(2)SDH和CCO酶活性分析:α-生育酚保护组神经元SDH和CCO酶活性高于单纯氧自由基损伤组.结论 α-生育酚可以有效对抗氧自由基对神经元线粒体的损伤.
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α生育酚对永生化人角质形成细胞内谷胱甘肽生成的影响及其机制研究
目的:探讨α-生育酚(α-Tocopherol)对角质形成细胞(keratinocyte)中谷胱甘肽(GSH)表达水平的调节作用,并进一步比较其他几种抗氧化剂对GSH调节的作用机制.方法:人皮肤角质形成细胞HaCaT细胞经不同的试验处理后分为空白组,α-生育酚处理组,多种抗氧化剂处理组,抑制剂干预组.测定各处理组中谷胱甘肽的含量以及谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)的表达量.结果:添加α-生育酚和醋酸维生素E(tocopheryl acetate)、苯甲醚(BHA)可以显著地口加细胞内谷胱甘肽的含量,而添加抗坏血酸(AsA)和甲基苯酚(BHT)不影响细胞内GSH的水平.同时添加谷氨酰半胱氨酸合成酶的阻断剂丁胱亚磺酰亚胺(BSO)(dl-buthionine-[S,R]-sulfoximine)和放线菌素D(actinomycin-D),可明显阻断α-生育酚对谷胱甘肽含量的调节功能.结论:α生育酚对皮肤细胞发挥抗氧化作用的主要途径是影响细胞内谷胱甘肽的生物合成,其主要作用机制是通过调控细胞内谷氨酰半胱氨酸合成酶的表达水平,从而加速细胞内谷胱甘肽的生物合成.
