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大豆异黄酮抗高脂型大鼠主动脉血管壁粥样硬化斑块形成研究
目的研究高含量的大豆异黄酮(ISO)与高脂型动脉硬化(AS)体内发生过程中iNOS基因表达之间的关系.方法采用总异黄酮含量为72.4%的大豆异黄酮作为受试物,设30 mg/kg、90 mg/kg、270mg/kg 3个剂量组,同时设雌激素(己烯雌酚)对照组,与AS高脂模型组、正常饲料对照组,喂饲Wistar大鼠,随时观察对大鼠体征(体重、脏体比值)的影响,运用光学显微镜检测HE染色的主动脉壁横切面病理改变,采用RT-PCR、Western-blot法检测血管壁内iNOS的mRNA和蛋白表达,并运用生化法检测血清中NO含量以及NOS活力.结果大豆异黄酮可以剂量-效应地抑制高脂饲料诱导的大鼠主动脉血管壁病理变化,增加血液中NO和NOS活力,显著增进血管壁内iNOS的mRNA和蛋白表达(与高脂模型对照组相比P＜0.05).结论高脂饲料可以诱导大鼠主动脉壁形成动脉粥样斑块,并降低血清中NO含量和NOS活力,减少iNOS基因在主动脉内的表达,大豆异黄酮可以减轻高脂饲料诱导的主动脉壁病理变化,增进血清中NO含量和NOS活力,促进iNOS基因在主动脉内的表达,且这种作用可能与植物雌激素作用无关,与抗氧化分子结构有关.
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DHPLC方法对中国人iNOS基因Tsp多态性的发现与初步证实
目的: 探讨中国人iNOS基因是否存在单核苷酸多态性及其在中国人中的频率.方法:DHPLC方法结合直接测序和PCR-RF LP技术,在有代表性的中国人中进行筛查.结果:在iNOS基因全部被测外显子中,有6 个外显子发现可疑双峰图型,可能存在杂合突变,对其测序后在iNOS基因第16外显子发现C→T突变 (称为Tsp多态性),使编码的氨基酸由丝氨酸 (serine,Ser)改变为亮氨酸 (leucine,Leu),设计PCR-RFLP方法并监测全部测序样本,PCR -RFLP与测序结果一致.在有代表性的43例中国人中,Ser和Leu等位基因频率分别为75.58% (65/86)和24.4 2% ( 21/86);三种基因型观察频率分别潍 Ser/Ser:62.79%; Ser/Leu:25.58%; Leu/Leu:1 1.63%, 与期望频率(分别为57.12%, 36.91%和5.96%)差异无显著性(P>0.05),说明符合H ardy -Weinberg遗传平衡定律.结论:中国人群中存在iNOS基因Ts p多态性,且频率较高.
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8-Br-cAMP对Eca-109细胞c-myc,wtp53,iNOS基因和EGFR表达的影响
目的:探讨8-Br-cAMP对Eca-109细胞c-myc、wtp53、iNOS基因和EGFR表达的影响.方法:将贴壁培养的Eca-109细胞随机分为2组:①实验组:加8-Br-cAMP至终浓度为2×10-5mol/L,培养24 h;②对照组:不加8-Br-cAMP,培养24 h.对2组的细胞涂片和硝酸纤维素膜(NCM)标本进行c-myc、wtp53、iNOS基因和EGFR表达检测,并对扫描数值进行统计学处理.结果:原位杂交及免疫组化反应信号皆定位于Eca-109细胞的胞质,扫描数值显示:①c-myc mRNA:实验组为3.38±0.99,对照组为5.18±1.39;②wtp53 mRNA:实验组为2.74±0.83,对照组为0.38±0.27;③iNOSmRNA:实验组为4.52±0.74,对照组为2.63±0.13;④EGFR-IR:实验组为2.37±1.05,对照组为4.38±0.48.以上实验组与对照组比较差异有统计学意义(P均<0.05).结论:c-myc、wtp53和NO均可参与8-Br-cAMP诱导癌细胞的分化效应.
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腺病毒介导的激活大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞中NO/cGMP通路的实验研究
目的:探讨靶向大鼠iNOS基因的shRNA重组腺病毒载体对大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞iNOS基因的激活作用,为阴茎勃起功能障碍(ED)的基因治疗提供实验依据.方法:将前期构建的重组腺病毒Ad5-iNOSrshRNA-EGFP(AdU6/shiNOS)和对照病毒AdU6/shControl,分别转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞,分别在不同病毒MOI(25,50,75)值下72小时后采样检测.采用realtime RT-PCR半定量检测AdU6/shiNOS对细胞iNOS基因mRNA表达影响；Western-blot法检测海绵体平滑肌细胞iNOS蛋白表达变化.然后培养基中加L-Arg(10 mmol/L),用酶联免疫法检测病毒转染72小时后海绵体平滑肌细胞内cGMP的浓度变化,记录AdU6/shiNOS对平滑肌细胞内cGMP的影响.结果:AdU6/shiNOS转染大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞72小时后,和空白对照组、阴性对照组相比iNOS基因在mRNA和蛋白表达水平均显著上调(P＜0.05),呈剂量依赖性,MOI=75时RNAa效果好.而且转染72小时后,实验组原代平滑肌细胞内cGMP水平显著高于对照组及空白组(P＜0.05).结论:利用腺病毒介导的RNAa技术,提高海绵体平滑肌细胞iNOS基因表达获得成功,可以增加阴茎海绵体平滑肌细胞cGMP水平,激活了NO/cGMP通路,这为勃起功能障碍的基因治疗研究开辟了新的方向.
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与排异反应相关基因克隆及其反义转基因载体构建
目的克隆与排异反应密切相关的iNOS基因cDNA片段,并构建反义转基因载体.方法培养人血管内皮细胞HVEC细胞株,采用反转录-pCR方法获取iNOS cDNA基因片段,并克隆入T载体并进行序列分析.用HindⅢ与BamHI双酶切带有iNOS cDNA片段的T载体质粒与pCDNA5载体,回收酶切产物,连接,转化,提取质粒并酶切鉴定.结果RT-PCR获取了669 bp的iNOS基因片段;序列分析表明克隆的iNOS片段序列正确;双酶切分析显示克隆入pCDNA3载体的iNOS基因片段与预期的大小一致.结论克隆了iNOS基因片段,并构建了iNOS的反义转基因载体.
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miRNA-451表达质粒的构建及其对iNOS基因表达的抑制
目的:探讨miRNA-451对肾小球系膜细胞中诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)基因表达的影响.方法:依据miRBase数据库中mmu-miR-451序列,设计两条寡核苷酸片段,退火处理后克隆至pGenesil-1质粒,构建pGenesil-1-miRNA-451质粒及阴性对照质粒pGenesil-1-control.将pGenesil-l-miRNA-451及pGenesil-1-control质粒分别转染小鼠肾小球系膜细胞,经G418筛选,建立稳定表达pGenesil-1-miRNA-451及pGenesil-1-control的细胞株.采用MTT比色法检测活细胞数并绘制生长曲线;RT-PCR、Western blot及免疫细胞化学检测iNOS基因表达的差异.结果:经测序证实重组质粒构建成功,与未处理的小鼠肾小球系膜细胞和稳定表达pGenesil-1-control的细胞相比,在稳定表达pGenesil-1-miRNA-451的小鼠肾小球系膜细胞中,细胞增殖受到抑制,iNOS基因的蛋白表达明显受到抑制,而iNOS基因的mRNA水平无明显变化.结论:miRNA-451在翻译水平抑制了iNOS基因的表达,并对小鼠肾小球系膜细胞生长具有显著的抑制作用.
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pVAX-iNOS真核表达载体的构建及其抗肺癌作用研究
背景与目的 iNOS与NO介导的抗肿瘤效应有关.本研究旨在构建pVAX-iNOS载体并转染A549肺癌细胞,检测其基因的表达并初步探讨iNOS基因表达增高后对A549肺癌细胞的抗肿瘤作用.方法 应用RT-PCR方法扩增人iNOS编码序列的CDS片段,构建pVAX-iNOS载体后转染肺癌A549细胞,通过RT-PCR和Western blot方法检测目的基因的表达；采用MTT法、Hoechst 3235染色和划痕实验分别检测iNOS高表达在体外对肺癌A549细胞增殖、凋亡和迁移作用的影响.结果 真核表达质粒载体pVAX-iNOS构建成功,iNOS蛋白在转染后的A549细胞中表达升高.pVAX-iNOS转染A549肺癌细胞后能明显诱导细胞发生凋亡并抑制肿瘤细胞的生长和迁移.结论 本研究成功构建pVAX-iNOS真核表达质粒,高表达iNOS能明显抑制A549细胞的增殖、迁移并促进细胞发生凋亡.本研究有望为临床治疗肺癌提供一个新的有效策略.
