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佛波酯诱导THP-1细胞分化条件的优化及自噬模型的建立
目的 探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate,PMA)诱导THP-1细胞(人类单核/巨噬细胞)分化的优条件,建立相关自噬模型,为基于细胞自噬模型的研究奠定实验基础.方法 采用PMA诱导THP-1细胞分化成巨噬细胞;用表达融合蛋白pcDNA3.1-YFP-LC3质粒转染THP-1细胞,YFP为黄绿色荧光蛋白,以示踪自噬体的形成.采用倒置显微镜观察不同浓度(0、10、20、50、100、200 ng/ml)、不同时间(0、24、48、60 h)PMA分化细胞形态学变化;采用荧光显微镜示踪不同条件下LC3点聚集的增强;实时荧光定量聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测自噬相关基因mRNA的表达.采用SPSS17.0软件进行统计分析.mRNA相对含量2-△△Ct用“(x)±s”表示.经比较Ct值法分析基因表达差异.Earle's balanced salts solution(EBSS,又称饥饿培养基),诱导细胞自噬相关基因mRNA表达量变化的比较采用t检验分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 PMA浓度为100 ng/ml、诱导时间为24～48 h时,THP-1细胞分化成巨噬细胞的形态学状态较理想.饥饿培养基EBSS处理分化的THP-1细胞,能增加自噬体YFP LC3点聚集,其自噬相关基因LC3、Atg5、Atg7、Beclin1的mRNA表达水平显著增加(2-△△Ct均值分别为1.35±0.16、1.18±0.39、1.44±0.12、1.08±0.09,t值分别为4.00、2.90、5.16、3.57,P值均＜0.05).结论 PMA在浓度为100 ng/ml、24～48 h时诱导THP-1分化为巨噬细胞状态较理想;成功构建了THP-1源性细胞自噬模型.
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PMA联合钙离子载体诱导K562细胞向树突状细胞分化
目的 探讨卟啉醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)联合钙离子载体(CI)诱导K562细胞向树突状细胞(DC)分化的作用. 方法 对数生长期的K562细胞在含PMA和CI的培养液巾培养96 h后,倒置相差显微镜下观察细胞形态,用流式细胞仪检测细胞表型,用MTT法检测其刺激淋巴细胞增殖的能力. 结果 PMA联合CI组细胞形态发生明显变化,表面出现许多细小的突起,细胞表面CD83、CD86、CD80、CD40、HLA-DR和CD1a表达上调,并且可以刺激淋巴细胞的增殖反应. 结论 PMA联合CI可以有效地使K562细胞向DC分化.
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佛波酯对人早幼粒白血病细胞系细胞分化和凋亡的诱导作用
目的:探讨佛波酯(TPA)对人早幼粒白血病细胞系(HL-60)分化和凋亡的影响.方法:利用TPA体外培养HL-60细胞,依据形态学和细胞化学的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪等技术进行分析.结果:7.2×10-6mol/L的TPA可使HL-60细胞出现向单核/巨噬细胞分化的形态特征,随培养时间延长,可见HL-60细胞核固缩、染色体断裂、凋亡小体形成等细胞凋亡的形态学改变.TPA处理24h可使酸性非特异酯酶(α-NAE)的活性和四氮唑蓝(NBT)还原能力显著增强,DNA琼脂糖凝胶电泳显示典型的"梯子"状带纹.TPA处理0、24、48h凋亡细胞百分数分别为(4.31±1.23)%、(15.10±1.31)%和(23.20±3.36)%,在整个实验过程中细胞周期时相、Bcl-2蛋白含量无明显变化.结论:TPA可诱导HL-60细胞向单核/巨噬样细胞分化与凋亡,且此凋亡过程可能与细胞周期时相、Bcl-2蛋白无关.
