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双向等位基因特异性PCR快速区分纯合子和杂合子SNP分型的新方法
目的 建立一种基于单碱基改变基因分型的快速检测等位基因特异性双向PCR原理的改良SNP分型新方法:双向等位基因特异性PCR(Bi-PASA)在一次PCR反应中区分纯合子和杂合子的方法.方法 以SNP位点rs11293201和rs57148397为例,设计两个外部引物(F与R)和两个内部等位基因特异性引物(P与Q).同时与测序方法对比检测突变.结果 两个内部引物(P和Q)包含一个相对短的完全匹配区域和一个富含Gc的10核苷酸5'尾.当基因组DNA被先期扩增出的模板DNA取代时内引物完成从低效扩增到高效扩增的转变,其结果与直接测序完全一致.利用Bi-PASA参数的优化在人类SIP1基因常见突变的外显子中详细研究先天性巨结肠病,3种额外的Bi-PASA分析被快速优化.结论 Bi-PASA是一种简单快速而有效的SNP分型新方法,是在一个PCR反应中检测已知突变的方法.
关键词： 单核苷酸多态性 双向等位基因特异性PCR SIP1基因 先天性巨结肠病 -
SIP1基因在先天性巨结肠症中的表达研究
目的 研究SIP1 (smad-interacting protein 1)基因在先天性巨结肠症(Hirschsprung Disease,HD)中的表达情况,探讨SIP1与HD发病的关系.方法 利用荧光实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、蛋白印迹(Western blot)和免疫组化方法检测30例HD狭窄段(无神经节细胞)和正常段(神经节细胞)肠管组织患儿SIP1的表达,并对其表达进行定量与比较分析.结果 SIP1在HD狭窄段肠管中mRNA表达为19.19±0.23,均高于正常段肠管中的表达11.06±1.12,差异有统计学意义(P＜0.05).Western Blot结果显示,SIP1在HD狭窄段肠管中蛋白相对含量为53.73±0.49,明显高于正常段肠管蛋白含量18.32±1.54,差异有统计学意义(P＜0.05).免疫组化结果显示,SIP1在HD狭窄段肠管中高表达,呈棕黄色；正常段肠管低表达,无色或淡黄色.结论 SIP1 mRNA与蛋白在HD狭窄段肠管中高表达,提示SIP1与HD的发生有密切关系,可能在先天性消化道畸形的肠道发育中具有重要作用.
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SIP1单核苷酸多态性rs41292293和rs34961586与先天性巨结肠的关系
目的 探讨SIP1基因单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)rs41292293和rs34961586与先天性巨结肠病(Hirschsprung disease,HSCR)关系,为评估HSCR患病风险奠定基础.方法 提取病例组(HSCR患儿)和对照组(正常健康人)各180例外周血基因组DNA,聚合酶链反应(polyrnerase chain reaction,PCR)法扩增SIP1基因2个外显子(exon5-rs41292293和exon6-rs34961586),PCR产物用限制性内切酶HhaⅠ和RsaⅠ消化与测序,以进一步确定基因突变位点,应用χ2检验统计分析病例组和对照组等位基因频率、基因型频率及其患病风险.结果 HSCR组与对照组SIP1 rs41292293 GA和GG基因型频率及A和G等位基因频率差异显著(P<0.05),AA基因型高于GG基因型,AG在HSCR组中存在多态性,对照组与HSCR SNPs基因型分布GA、AA和GG分别为48.89%、35.00%和16.11%与37.78%、49.44%和12.78%,比较发现A(68.33%)和G(31.67%)等位基因频率有显著性差异(P<0.05);HSCR组与对照组SIP1 rs34961586 GC和GG基因型频率及C和G等位基因频率差异显著(P<0.05),GG基因型显著高于CC基因型,GC在HSCR组中存在多态性,对照组与HSCR SNPs基因型分布GC、GG和CC分别为34.44%、56.11%和9.45%与46.11%、39.44%和14.45%,比较发现G(65.83%)和C(34.17%)等位基因频率有显著性差异(P<0.05).测序rs41292293第268和256位密码子核苷酸CCC→CGA和TGG→TGT杂合突变;rs34961586第135位密码子核苷酸CCA→CAC、TGC→TTC和TGC→TGG杂合突变.结论 SIP1 rs41292293和rs34961586与HSCR的发生有密切关系.为进一步研究该基因SNPs与其生理功能和疾病的关系提供基础资料.
关键词： Hirschsprung病 SIP1基因 多态性 单核苷酸 等位基因 -
SIP1基因编码区点突变及多态性在先天性巨结肠症中的检测与分析
目的 检测先天性巨结肠症(Hirschsprung disease,HSCR)患者SIP1(Smad-interacting protein 1)基因编码区点突变及单核苷酸多态性特点,探讨SIP1基因与HSCR的关系.方法 应用聚合酶链反应.单链构像多态性(polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism,PCR-SSCP)和DNA直接测序技术,对50例HSCR、30名正常对照外周血SIP1基因编码区的10个外显子,进行点突变与单核苷酸多态性的检测与分析.结果 HSCR与正常对照突变图谱比较,有1例病例在第7外显子出现杂合性缺失,密码子157位点GTG→GTA置换,引起亮氨酸的同义突变,属于单核苷酸多态性,突变率为2%(1/50).有4例患者在第8外显子出现突变,突变率为8%(4/50).PCR-SSCP银染分析,第2外显子2例出现相同类型泳动变位;第7外显子3例出现相同类型泳动变位;第8外显子7例出现相同类型泳动变位.结论 HSCR有SIP1基因突变,提示SIPI基因与HSCR的发病存在一定程度的关联.
