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工程化生长转化因子β3促进软骨前体细胞向软骨分化的实验研究
目的:构建LAP(latency associated peptide in TGF-beta,LAP)为潜伏作用,MMP(matrix metalloproteinase,MMP)酶切位点为导向作用,TGF-β3活性部分为治疗作用的具有靶向治疗功能的工程化TGF-β3蛋白,并转染软骨膜来源的软骨前体细胞(chondrogenic progenitor cells,CPCs),检验其特异性的靶向治疗作用.方法:将人工合成的编码MMP酶切位点氨基酸的正反义DNA序列经基因重组定向克隆插入真核表达载体pIRES-EGFP中,之后将大鼠的TGF-β3的LAP段和TGF-β3的活性片断(mature TGF-β3,mTGF-β3),分别插入到MMP的上游和下游,获pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3重组质粒.然后将其转染入软骨膜来源的CPCs,将转染后的CPCs在有MMP-1和无MMP-1的条件下进行球团培养,并分别检测胶原Ⅱ(COLⅡ),Aggrecan(Agc)和TIMP的表达.结果:经过测序和酶切鉴定,成功构建了pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3质粒,转染CPCs后,只有MMP酶存在的条件下才能有效的促进CPCs向软骨分化和软骨基质的合成.结论:通过基因工程构建的工程化TGF-β3具有靶向性促进软骨前体细胞修复软骨的应用前景.
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免疫分选软骨前体细胞并诱导永生化的研究
目的 建立永生化大鼠软骨前体细胞株,为细胞移植和转基因治疗提供稳定的细胞来源.方法 利用免疫磁珠技术分离纯化具有特异性表面标志成纤维生长因子受体-3(FGFR-3)的软骨前体细胞,用基因转染技术将含有猿肾病毒40大T抗原基因(SV40Tag)的重组质粒pEGFPIRES2-SV40Tag转染原代培养的新生大鼠软骨前体细胞,经G418筛选,抗性克隆扩大培养.应用FGFR-3、Ⅱ型胶原和X型胶原抗体进行细胞鉴定,检测其分化能力,观察细胞的形态及其生长状况,绘制生长曲线.用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、Southern blot和免疫细胞化学法鉴定SV40Tag在转染细胞中的表达.结果 获得1个阳性细胞克隆,免疫细胞化学证实为FGFR-3阳性的具有较强增值能力和多分化潜能的软骨前体细胞.经Southern印迹杂交证实,SV40Tag已稳定转染人软骨前体细胞,表达mRNA及其蛋白.贴壁培养的永生化软骨前体细胞株(IPSC),群体倍增时间为23.62 h,传代、冻存和复苏对细胞形态及生长无明显影响.结论 SV40Tag导入可诱导软骨前体细胞永生化,为软骨前体细胞的实验研究及其介导的细胞移植治疗提供了稳定的细胞来源.
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白藜芦醇促进软骨细胞肥大化的作用机制研究
目的 探讨白藜芦醇(resveratrol,RES)对软骨前体细胞ATDC5肥大化的影响及其可能机制.方法 通过CCK-8法研究不同浓度RES对ATDC5细胞活性的影响.建立软骨肥大化诱导体系,根据活性实验的安全浓度,设立对照组(0μmol/L)和RES组(1mol/L).qRT-PCR和Western blot法确定肥大化相关因子RUNX2、MMP13和COLX表达变化;甲苯胺蓝和免疫组化分析细胞外基质粘多糖及COLX、RUNX2表达;利用qRT-PCR检测软骨细胞肥大化经典通路WNT、IHH和FGF中相关因子的表达变化.结果 RES安全使用浓度为1μmol/L;与对照组相比,在肥大化诱导14 d后,RES组ATDC5细胞肥大化水平明显提升;RES组肥大化相关基因表达量在3、7、14 d时明显增加;WNT和IHH途径中促肥大化因子β-catenin和GLI2的表达水平在RES组较对照组升高,而GLI3表达水平下降.FGF途径中PI3K的表达水平较对照组没有变化.结论 RES通过激活β-catenin及GLI2,抑制GLI3,促进RUNX2表达,实现促进ATDC5肥大化的目的.
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大鼠软骨非全层损伤模型的建立及活化细胞与整合素β1表达关系的研究
目的 探讨大鼠软骨非全层损伤模型的制备及术后细胞变化及细胞活化与整合素β1表达的关系.方法 10周龄SD雄性大鼠45只,体质量300～400 g,随机分为手术组、假手术组和对照组,每组15只.手术组采用划痕法制造软骨非全层损伤模型;假手术组打开膝关节囊后直接缝合;对照组不行手术.术后1、7、14 d各组分别处死5只大鼠,取材行大体观察;并行HE、番红O组织学染色,评估并比较各组HE染色改良组织学评分及番红O染色灰度值;行BrdU、CD105免疫荧光染色和CD105/整合素p1双标记染色,采用标准双盲法计数并比较各组各时间点CD105阳性细胞数.结果 大体观察示手术组划痕周围软骨欠光滑,非透明,有软骨软化、纤维化改变,且随造模时间延长逐渐加重;假手术组和对照组软骨呈白色透明状,无软化、纤维化改变.HE染色示手术组在划痕周围细胞数增多,大小不等,排列分布不均;假手术组和对照组细胞大小均一,染色均匀,排列有序.手术组术后各时间点HE染色改良组织学评分均显著高于假手术组及对照组(P＜0.05),各组组内各时间点间比较差异均无统计学意义(P＞0.05).番红O染色示手术组各时间点染色欠均匀,划痕周围区域着色较浅;假手术组和对照组各时间点染色均匀,无失染.术后各时间点各组间比较以及各组内各时间点间比较番红O染色灰度值,差异均无统计学意义(p＞0.05).BrdU免疫荧光染色示手术组划痕周围细胞排列紊乱,分布不均;假手术组和对照组细胞排列分布均匀,无聚集现象.CD105免疫荧光染色示手术组划痕周围有较多阳性细胞聚集,细胞大小不一、分布不均;假手术组和对照组软骨层见少数阳性细胞,分布均匀.手术组术后各时间点CD105阳性细胞数均显著多于假手术组和对照组(P＜0.05);手术组内随时间延长CD105阳性细胞数逐渐增多,各时间点间比较差异均有统计学意义(P＜0.05).CD105/整合素p1双荧光标记染色示手术组划痕周围有双标阳性细胞聚集,假手术组和对照组各时间点均未观察到双标阳性细胞.结论 通过划痕能够建立大鼠软骨非全层损伤模型,且损伤无法完全修复.划痕造成的软骨损伤周围存在活化细胞聚集现象,细胞的活化与软骨基质改变关系不大;这些活化细胞处于增殖活跃状态,可同时表达CD105和整合素p1.
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软骨前体细胞的分离鉴定及IL-1β对其成软骨分化的影响
目的 对正常软骨中的软骨前体细胞进行分离、鉴定,并对不同浓度IL-1β对软骨前体细胞的成软骨分化影响进行研究.方法 取正常成年新西兰大白兔的软骨细胞,通过纤连蛋白粘连分离出软骨前体细胞,采用流式细胞仪对其细胞表型进行鉴定,倒置相差显微镜观察其克隆增殖,并行成骨、成脂、成软骨三系分化观察.培养软骨前体细胞团并分为4组,分别加入普通H-DMEM培养基(A组)、成软骨诱导分化培养基(B组)、成软骨诱导分化培养基+0.1 ng/mL IL-1β(C组)、成软骨诱导分化培养基+1.0 ng/mL IL-1β(D组),培养3周行组织学、生物化学、实时荧光定量PCR等检测,观察IL-1β的影响.结果 在正常软骨细胞中存在软骨前体细胞,经鉴定有干细胞表型阳性表达,有与干细胞相似的克隆增殖能力及分化能力.HE染色示,C、D组中细胞团块较B组明显减小,细胞呈肥大样改变.番红O、Ⅱ型胶原及X型胶原染色示,B组较A组染色深,C、D组均浅于B组,D组浅于C组.生物化学成分测定示,C、D组的总胶原、糖胺聚糖(glycosaminoglycan,GAG)相对含量及GAG/DNA比值均显著低于B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05);C、D组DNA相对含量均显著高于B组(P＜0.05),但C、D组间差异无统计学意义(P＞0.05).实时荧光定量PCR检测示,C、D组Ⅱ型胶原、X型胶原、Sox-9mRNA相对表达量均显著低于B组,D组显著低于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05);而C、D组Runx-2和MMP-13mRNA相对表达量均显著高于B组,D组显著高于C组,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 在正常软骨组织中存在一种有干细胞特性的软骨前体细胞,其有克隆和潜在分化的能力.IL-1β对软骨前体细胞成软骨分化有抑制作用,并有促进成骨分化的可能.
