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GIT1发夹结构干扰MLC的分布及其磷酸化
目的:探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1,GIT1)的RNA发夹结构(hairpin)(GIT1-RNAh)对成骨细胞内肌球蛋白轻链(myosin light chain,MEt)的分布及磷酸化的影响,并分析其机制.方法:取培养至第6代的鼠成骨细胞,随机分成两组,分别用包含GIT1-RNAh(实验组)和绿色荧光蛋白(green fluoresence pro tein,GFP)的发夹结构(GFP-RNAh)的腺病毒(对照组)感染12 h,再将每组分成有、无血小板衍生生长因子(platelet-drived growth factor,PDGF)刺激的两组,免疫荧光染色方法检测成骨细胞内MLC的位置,Western blot检测MLC的磷酸化.结果:免疫组织化学观察:和对照组相比.实验组明显扰乱了成骨细胞MLG的分布;Western blot观察:和对照组相比,实验组明显抑制了MLC的磷酸化(P<0.05).结论:GIT1的发卡结构过表达可干扰MLC的分布和其磷酸化.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 MLC 血小板衍生生长因子 -
GIT1通过BMP-2/p-Smad1/5/8信号通路调节骨折愈合
目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 (G-protein coupled receptor kinase-interacting protein 1,GIT1)影响骨折愈合的具体机制.方法:分别取GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只.造模成功后2周,免疫组化检测骨痂区软骨细胞矿化及p-Smad1/5/8表达量.分别取2组小鼠的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),予以10 ng/mL的骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)刺激后检测Smad1/5/8磷酸化水平和核转入能力;取C3H10T1/2细胞,分别用1μg pGL3重组质粒和1μg GIT1-siRNA共转染细胞,荧光报告素酶技术检测细胞内GIT1蛋白对BMP2转录水平的影响.结果:与同窝野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠软骨内骨化减弱,骨痂区软骨细胞堆积,骨折愈合延迟,p-Samd1/5/8表达水平明显减少;与GIT1基因敲除小鼠相比,BMP2可明显提高同窝野生型小鼠BMCs中p-Samd1/5/8核转入能力;GIT1蛋白表达的缺失可明显降低BMP2的转录水平.结论:GIT1可通过调节Samd1/5/8的磷酸化及BMP2信号转导影响骨折部位的软骨内骨化.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 骨形态发生蛋白2 骨折愈合 软骨内骨化 -
GIT1蛋白通过调节血管形成促进骨折愈合
目的:探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)在骨折愈合过程中的作用.方法:应用GIT1基因敲除小鼠和同窝野生型小鼠制作股骨骨折模型,每组30只.造模成功后7、14、21 d,应用X线、micro-CT、PECAM1免疫荧光染色等方法分析骨痂体积及新生血管情况.结果:与野生型小鼠相比,GIT1基因敲除小鼠骨折愈合延迟,骨痂内新生血管的体积和数量减少.结论:GIT1基因缺失导致骨痂区新生血管减少,从而延迟骨折愈合.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 骨痂 新生血管 -
GIT1基因表达缺失对骨折愈合过程中软骨细胞的影响
目的 探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)基因表达缺失对骨折愈合过程中软骨细胞增殖和凋亡的影响.方法 应用GIT1基因敲除小鼠(A组,30只)和同窝野生型小鼠(B组,30只)制作股骨骨折模型.造模成功后7、14和21d,采用免疫组化和免疫荧光法检测骨痂区软骨细胞增殖能力和凋亡情况.结果 与B组相比,A组小鼠骨痂区软骨细胞堆积,软骨细胞增殖能力减弱,凋亡能力下降(P＜0.05).结论 GIT1基因表达缺失可能会导致骨折愈合延迟.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 软骨细胞 骨折愈合 -
GIT1发夹结构对骨折愈合过程中破骨细胞招募分化的影响
目的 探讨G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)的RNA发夹结构对骨折愈合过程中破骨细胞分化的影响.方法 制作闭合性大鼠左侧胫骨标准骨折模型,将40只大鼠分成两组,每组20只.对照组于骨折端注射含GIT1WT的慢病毒,实验组骨折端注射含GIT1的RNA发夹结构(GIT1-RNAh)慢病毒.用Western blot检测蛋白表达；骨折愈合7、14、21 d,用免疫组化法检测破骨细胞在骨折端的招募,免疫荧光染色方法检测骨折端的血管形成.结果 对照组骨折端的骨痂内检测到GIT1蛋白的表达.实验组骨折端的骨痂内GIT1蛋白的表达明显被抑制,破骨细胞在骨折端的数量明显减少,骨折端的新生血管的形成明显被抑制.结论 GIT1-RNAh通过降低GIT1蛋白的表达抑制了破骨细胞的分化和血管形成,从而影响骨折愈合.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 破骨细胞招募 -
GIT1发夹结构对成骨细胞内局部黏附激酶的磷酸化和分布的影响
目的 探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1的RNA发夹结构(GIT1-RNAh)对成骨细胞内局部黏附激酶(FAK)的磷酸化和分布的影响.方法 成功构建含GFP-RNAh和GITlRNAh的腺病毒,在血小板衍生生长因子(PDGF)刺激的条件下,免疫荧光染色法检测成骨细胞内FAK的蛋白分布,Western blot检测FAK的磷酸化水平,Image J软件检测成骨细胞的扩增面积.结果 与感染GFP-RNAh的成骨细胞相比,在PDGF刺激条件下,GIT1-RNAh明显抑制FAK磷酸化水平(P<0.05),扰乱FAK的分布,抑制成骨细胞的面积扩增(P<0.05).结论 GIT1-RNAh通过扰乱FAK的分布及其磷酸化抑制成骨细胞的面积扩增.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 RNA发夹结构 局部黏附激酶 成骨细胞 -
GIT1发夹结构对骨折愈合过程中软骨细胞分化的影响
目的 探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(GIT1)的RNA发夹结构对骨折愈合过程中软骨细胞分化的影响.方法 按Hiltunen A方法制作闭合性大鼠左侧胫骨标准骨折模型,将40只大鼠均分成两组:对照组于骨折端注射含GIT1 WT的慢病毒;实验组骨折端注射含GIT1 RNA发夹结构(GIT1-RNAh)的慢病毒.Western blot检测蛋白表达,免疫组化法检测骨折愈合14、21 d软骨细胞内Ⅱ型胶原的表达,免疫荧光染色方法检测骨折愈合14、21 d软骨细胞的凋亡.结果 对照组骨折端的骨痂内检测到GIT1蛋白的表达;而实验组骨痂内GIT1蛋白的表达明显被抑制,软骨细胞片常增生,Ⅱ型胶原的表达明显增加,软骨细胞的凋亡明显被抑制.结论 GIT1-RNAh通过降低GIT1蛋白的表达干扰了软骨细胞的分化,从而影响骨折愈合.
关键词： G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1 软骨细胞分化 -
G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1发夹结构通过影响Paxillin的功能抑制成骨细胞迁移
目的 探索G蛋白偶联受体激酶结合蛋白1(G protein coupled receptor kinase interacting protein 1, GIT1)的RNA发夹结构(hairpin)(GIT1-RNAh)对成骨细胞迁移的影响,并分析其机制.方法 取培养至第6代的鼠成骨细胞,随机分成两组,分别用包含GIT1-RNAh(实验组)和绿色荧光蛋白(green fluoresence protein, GFP)的RNA发夹结构(GFP-RNAh)的腺病毒(对照组)感染12 h后,再将每组分成有、无血小板源性生长因子(platelet drived growth factor, PDGF)刺激的两组.免疫荧光染色方法检测成骨细胞内源性GIT1蛋白表达和Paxillin的位置.Western Blot检测Paxillin的磷酸化.构建包含蓝色荧光蛋白的GIT1-RNAh(CFP-GIT1-RNAh)实验组和GFP-RNAh(CFP-GFP-RNAh)(对照组), 免疫荧光双染的方法检测CFP-GIT1-RNAh和 CFP-GFP-RNAh对Paxillin位置的特异性作用.用划痕愈合法检测GIT1-RNAh(实验组)和GFP-RNAh(对照组) 腺病毒对成骨细胞在PDGF刺激下的迁移能力的影响.结果 免疫组织化学观察,实验组和对照组比较,明显抑制成骨细胞内源性的GIT1蛋白表达和扰乱Paxillin的分布.Western Blot观察,和对照组相比,实验组明显抑制了Paxiliin的磷酸化(P＜0.05).划痕愈合法检测观察,和对照组相比,实验组明显抑制成骨细胞的迁移.结论 GIT1-RNAh通过扰乱Paxillin的分布和其磷酸化从而抑制成骨细胞的迁移.
