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人p21活化激酶6基因真核表达质粒的构建及其亚细胞定位
目的:构建人p21活化激酶6(PAK6)真核细胞表达质粒,并研究其在人胚肾真核细胞HEK293中的亚细胞定位.方法:PCR扩增人PAK6基因,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1HisC中,构建含人PAK6基因的真核表达质粒pcDNA3.1HisC-PAK6.利用酶切鉴定,DNA测序,免疫印迹及免疫荧光方法鉴定PAK6真核表达质粒及PAK6蛋白的亚细胞定位.结果:经酶切鉴定、DNA测序、免疫印迹方法确认PAK6基因成功导入真核表达载体pcDNA3.1HisC.瞬时转染HEK293细胞,PAK6蛋白表达在细胞浆中.结论:PAK6真核表达质粒构建成功,PAK6定位于细胞浆中.
关键词： PAK6 真核细胞 pcDNA3.1HisC 亚细胞定位 -
微小RNA-23a-p21活化激酶6通路对前列腺癌细胞迁移与侵袭能力的影响
目的 探讨调控p21活化激酶6(PAK6)的微小RNA(miRNA)与前列腺癌侵袭及迁移的关系.方法 生物信息学预测靶向PAK6的miRNA,转染miRNA模拟物及抑制剂,Western blot 法及实时定量逆转录-聚合酶链反应( Real-time PCR)检测PC-3细胞PAK6的表达,荧光素报告酶实验检测预测miRNA对PAK6的调控,并行体外迁移及侵袭实验,检测转染miRNA对PC-3细胞迁移及侵袭能力的影响.结果 生物信息学预测miRNA-23a可能是调控PAK6的靶miRNA. Western blot检测转染miRNA-23a组PAK6表达量下降79％,而转染miRNA-23a抑制剂组PAK6表达量上升40％,差异均有统计学意义(P＜0.05).荧光素报告酶实验结果显示,转染miRNA-23a后野生型PAK6组荧光素酶活性下降32％,而突变组差异无统计学意义(P＞0.05).Real-time PCR检测3组PAK6 mRNA的表达,差异无统计学意义(P＞0.05).体外迁移及侵袭实验示,转染miRNA-23a组迁移细胞数减少57％,侵袭的细胞数减少91％.结论 微小RNA-23a通过下调靶蛋白PAK6的表达从而引起前列腺癌迁移及侵袭能力下降.
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P21活化激酶6在结肠癌组织中的表达及其意义
目的 探讨P21活化激酶6(PAK6)在结肠癌组织的表达水平及临床意义.方法 应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time PCR/qPCR)检测25例结肠癌患者肿瘤组织、配对的癌旁正常组织PAK6基因的mRNA表达水平,通过免疫组织化学的方法检测94例结肠癌及其癌旁正常组织PAK6的蛋白表达水平,并结合临床资料进行相关分析.结果 qPCR显示肿瘤组织中PAK6mRNA的表达水平显著高于癌旁正常组织(P＜0.01).免疫组织化学显示PAK6在正常组织低表达10.64％(10/94),在肿瘤组织中高表达64.89％(61/94);PAK6的表达量与肿瘤AJCC分期、肿瘤分化、Ki67表达水平和肿瘤远处转移显著相关(P＜0.05).Kaplan-Meier生存分析显示PAK6阳性组患者5年无病生存率及总体生存率均明显低于PAK6阴性组(P＜0.01);多因素COX回归模型分析发现PAK6高表达是影响结肠癌预后相关的独立危险因素.结论 PAK6在结肠癌组织中高表达,与肿瘤分期、分化及远处转移相关,可作为结肠癌预后判断的指标.
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PAK6基因的克隆、抗体制备及在前列腺癌中的表达
目的 在克隆P21相关激酶6(PAK6)全长cDNA的基础上,进一步克隆PAK6-N端基因并使其在大肠杆菌中高效表达,纯化基因产物并进行多克隆抗体制备,为研究PAK6与疾病的关系奠定基础.同时研究PAK6在前列腺癌中的表达.方法 根据人全长PAK6 cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,以PAK6全长cDNA为模板克隆PAK6-N端基因,将扩增产物克隆至大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1中,经EcoRI/XhoI双酶切鉴定后,进行DAN序列测定.GST-PAK6-N融合蛋白在硫代半乳糖苷(IPTG)诱导下在大肠杆菌BL21中得到表达.利用G1utothione亲和层析纯化融合蛋白,用纯化的GST-PAK6-N融合蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,并用纯化的抗PAK6多克隆抗体在3例前列腺癌病人标本中进行了免疫组化表达的初步研究.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断,在E.coli中表达了PAK6-NT,纯化了GST-PAK6-N融合蛋白,并制备了PAK6特异性抗体.免疫组织化学研究表明:3例前列腺癌患者石蜡包埋病理组织切片免疫组化染色全部表现为间质阳性,PAK6在前列腺癌间质中呈现表达,而前列腺癌细胞则不染色.结论 首次克隆了PAK6全长cDNA和PAK6-N端基因片断并成功制备了PAK6特异性抗体,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.初步揭示PAK6在前列腺癌的表达
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p21激活的磷酸化蛋白激酶6基因克隆、重组质粒载体的构建和序列分析
目的 测定PAK6在前列腺癌中的表达,探讨PAK6与前列腺癌的关系.方法 根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,进行DAN序列测定.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA,构建了pGEX-4T-1-PAK6-NT重组质粒载体并进行了序列测定.结论 克隆PAK6全长cDNA并进行了序列测定,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.
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PAK6对前列腺癌的双向调控作用
前列腺癌为一类男性患病率较高的癌症，对该癌症机制的认识以及治疗手段非常有限，在西欧和美洲男性中是一类致死率较高的癌症。随着科学研究的不断进展，p21活化激酶（PAK）蛋白家族在癌症中发挥的作用开始进入人们的视野。p21活化激酶6（PAK6）初是以雄激素受体的配体结合域（LBD）上的氨基酸序列629～919，通过酵母双杂交识别出来的雄激素受体相关蛋白。而雄激素与雄激素受体在前列腺癌的发生与发展中发挥了十分重要的作用，因此 PAK6蛋白作为前列腺癌治疗的靶向蛋白被不断研究。本文主要介绍 PAK6在前列腺癌中的双向调节作用，包括通过磷酸化雄激素受体抑制雄激素受体向核内转移的抑癌作用，和通过抑制 BAD 凋亡通路、影响前列腺癌细胞生长周期以及促进前列腺癌细胞从细胞集落中脱离的促癌作用。同时 PAK6的表达水平和激酶活性的调节对 PAK6在前列腺癌中发挥作用具有十分重要的意义。激素与生长因素和内质网应激可能是提高 PAK6表达水平和激酶活性的两条途径。PAK6在前列腺癌中发挥的作用与其表达水平和激酶活性的调节机制对前列腺癌的治疗手段以及其治疗药物的靶向目标具有十分重要的意义。
