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干扰AFP蛋白表达的shRNA表达载体的构建及活性鉴定
目的:利用含报告基因EGFP的pGenesil-1质粒构建干扰AFP蛋白表达的短发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA)表达的载体,并进行活性鉴定.方法:设计表达短发夹RNA的互补DNA序列,经退火成双链,克隆至带有U6启动子的质粒载体pGenesil-1中,构建重组质粒,转化大肠杆菌DH5α菌株,扩增,提取质粒,酶切鉴定后测序分析.构建正确的重组质粒经脂质体转染HepG2细胞,检测转染率和培养细胞上清的AFP含量变化,确定重组质粒的活性.结果:构建了靶向AFP蛋白的2个shRNA重组质粒载体pGenesil-1-siAFP1和pGenesil-1-siAFP2.酶切鉴定和测序分析,shRNA编码序列与设计的片段完全一致,经酶切凝胶电泳证实载体构建成功.重组质粒有效转染HepG2细胞并显著抑制AFP表达.结论:成功构建具有活性的、能够表达shRNA靶向干扰AFP蛋白的2个重组质粒载体.
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p21激活的磷酸化蛋白激酶6基因克隆、重组质粒载体的构建和序列分析
目的 测定PAK6在前列腺癌中的表达,探讨PAK6与前列腺癌的关系.方法 根据人全长PAK6cDNA序列,设计PCR引物,以人前列腺癌cDNA文库为模板利用PCR技术克隆PAK6全长cDNA.在此基础上,进行DAN序列测定.结果 成功克隆了PAK6全长cDNA,构建了pGEX-4T-1-PAK6-NT重组质粒载体并进行了序列测定.结论 克隆PAK6全长cDNA并进行了序列测定,为深入探讨PAK6在前列腺癌中的作用奠定了基础.
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人PD-L1真核表达载体的构建及结肠癌细胞稳定表达单克隆株的筛选和鉴定
目的:构建人程序性死亡配体1(PD-L1)重组质粒载体,筛选稳定高表达人PD-L1的结肠癌单克隆细胞株.方法:提取HCT116细胞总RNA,RT-PCR克隆PD-L1基因片段,将其重组至含有HA标签和Neo真核细胞筛选抗性的pcDNA3质粒载体上,转染HCT116细胞,倍比稀释8个细胞浓度至96孔板,G418筛选两周,挑取单细胞克隆,通过免疫印迹鉴定外源性PD-L1的表达;通过MTS、Transwell和软琼脂细胞克隆形成实验比较PD-L1低表达和高表达单克隆细胞株生长增殖、迁移和细胞克隆形成能力的差别;后通过在两组细胞中过表达帽依赖性荧光素酶报告基因阐述造成上述表型的可能机制.结果:成功构建人PD-L1的真核表达载体,并筛选获得稳定高表达PD-L1的HCT116单克隆细胞株.功能研究初步证明PD-L1可促进细胞克隆形成能力、迁移和生长增殖.过表达PD-L1可使帽依赖性荧光素酶报告基因的表达上调约3～4倍,表明其机制部分为PD-L1可上调帽依赖性蛋白质翻译.结论:获得了PD-L1重组质粒载体及可用于后续功能研究的稳定高表达人PD-L1的HCT116单克隆细胞株.
关键词： PD-L1 重组质粒载体 稳定高表达结肠癌单克隆细胞株
