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载脂蛋白D在常染色体显性多囊肾病中的表达及对囊肿衬里上皮细胞增殖的影响
目的 探讨载脂蛋白D (apolipoprotein D,ApoD)在常染色体显性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)发病中的作用.方法 采用免疫组织化学及蛋白质印迹方法分析ApoD在ADPKD患者肾脏囊肿组织中的表达；蛋白质印迹法和实时荧光定量PCR法分别检测Han:SPRD大鼠肾组织ApoD蛋白和基因表达的变化.应用MTT法检测人重组ApoD蛋白对ADPKD囊肿衬里上皮细胞(WT9-12)增殖的影响；流式细胞术检测经人重组ApoD蛋白作用后WT9-12细胞的凋亡情况及细胞周期改变.结果 ADPKD患者及Han:SPRD杂合型大鼠(cy/+)肾组织中ApoD表达量分别低于正常人及Han:SPRD正常大鼠(+/+)肾组织(P＜0.05,P＜0.01).8、12、16、24周龄Han:SPRD杂合型大鼠(cy/+)肾脏中ApoD基因表达量均低于同周龄Han:SPRD正常大鼠(+/+)(P＜0.05).人重组ApoD蛋白以100、200、400ng/ml作用于WT9-12细胞,作用48 h细胞增殖抑制率分别为8.21％、7.59％、8.07％(P＜0.05),作用72 h细胞增殖抑制率分别为8.62％、6.43％、9.42％ (P＜0.05).人重组表达ApoD蛋白以400 ng/ml浓度刺激细胞72 h,对细胞凋亡无明显影响,但可使G1期细胞增加8.26％,S期细胞减少8.09％ (P＜0.05).结论 ApoD蛋白可能通过调节细胞周期减弱WT9-12细胞增殖,其表达减少可能在ADPKD的发病过程中具有一定作用.
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塞来昔布通过抑制COX-2活性抑制Han:SPRD大鼠肾囊肿生长
目的:观察塞来昔布(celecoxib,CXB)对常染色体显性遗传性多囊肾病(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)模型Han:SPRD大鼠肾囊肿生长的作用,探讨其可能的作用机制.方法:3周龄杂合(cy/+)Han:SPRD大鼠随机分成3组(n=19):小剂量(3 mg·kg-1·d-1)、大剂量(10 mg·kg-1·d-1)CXB作用组及空白对照组.大鼠饲养至16周龄,称取体质量(TBW)及双肾质量(2K),计算2K/TBW;取肾组织行H-E染色及特殊染色,观察肾间质炎细胞浸润程度,测定囊肿指数、纤维化指数;采用免疫荧光共聚焦扫描法检测肾组织环氧化酶(COX)-2、增殖细胞核抗原(PCNA)共染的荧光斑表达丰度,采用Western印迹法检测肾组织COX-2、PCNA蛋白表达量.结果:小剂量CXB作用组大鼠2K/TBW低于空白对照组,差异有统计学意义[(1.10±0.009)% vs (1.33±0.02)%,P＜0.05].与空白对照组相比,小剂量、大剂量CXB作用组大鼠肾间质炎细胞浸润程度评分减轻[(2.6±0.26)、(2.8±0.31) vs (3.7±0.33),P＜0.05],肾囊肿指数[(42.9±6.56)、(47.1±7.28) vs (64.8±6.71)]、纤维化指数[(11.2±2.63)、(10.1±3.30) vs (16.3±4.16)]明显降低(P＜0.05).小剂量CXB作用组大鼠肾组织COX-2、PCNA共染的荧光斑强度较空白对照组明显减弱,差异具有统计学意义(P＜0.05);与空白对照组相比,小剂量、大剂量CXB作用组大鼠肾组织COX-2[(0.326±0.011)、(0.409±0.008)vs (0.814±0.012),P＜0.05]、PCNA表达量明显降低[(0.763±0.051)、(0.925±0.042)vs (0.988±0.031),P＜0.05].结论:3、10 mg·kg-1·d-1塞来昔布可能通过抑制COX-2活性,减轻炎细胞浸润而发挥抑制Han:SPRD大鼠肾囊肿生长的作用.
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组蛋白去乙酰化酶与多囊肾病
常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)是一种常见的遗传性疾病,发病率约为1/1 000～1/400.ADPKD中基因表达的表观遗传修饰和蛋白质功能的研究已成为近研究的热点.表观遗传乙酰化修饰中的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)参与调节了Pkd1基因的表达,其中HDAC5是液体流动引起的肾上皮细胞钙信号通路作用的靶点;HDAC6在囊泡表皮细胞中过度表达,通过α-tubulin去乙酰化参与调节纤毛形成和表皮生长因子受体(EGFR)的运输,并且通过β-catenin去乙酰化调节Wnt信号通路.HDAC抑制剂既能减少Pkd1基因条件性敲除小鼠囊肿的形成,又能延缓Pkd2基因敲除小鼠肾功能下降,因此抑制HDAC可能成为治疗ADPKD的新靶点.本文主要就ADPKD去乙酰化修饰方面的研究作一综述.
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腹腔镜肾囊肿去顶减压术治疗多囊肾的临床分析
目的 探讨后腹膜腹腔镜下去顶减压术(retroperitoneallaparoscopic cyst decompression,LRCD )治疗常染色体显性遗传性多囊肾病的方法(autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD)及疗效.方法 总结后腹膜腹腔镜下去顶减压术治疗ADPKD患者20例,对手术天数、术后平均引流量、手术前后肾功能、及血压情况进行分析.结果 术后随访3～18 个月,患者肾功能改善,,血压值kPa改善,手术前后对比有统计学意义(P＜0.05),B超、CT均未发现囊肿复发.结论 后腹膜腹腔镜下去顶减压术治疗常染色体显性遗传性多囊肾病手术创伤小、术中出血少、术后恢复快、疗效可靠,是一种比较积极可行的手术方法.
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富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白对囊肿衬里上皮细胞细胞周期及其调控基因表达的影响
目的研究富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白(SPARC)对人常染色体显性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞(CLECs)细胞周期及其调控基因表达的影响,初步探讨SPARC对CLECs的作用.方法体外条件下用不同浓度SPARC处理CLECs,5-溴-2脱氧尿苷酶联免疫吸附测定法(BrdU ELISA)测定CLECs增殖;流式细胞术检测细胞周期;实时荧光定量RT-PCR方法检测CLECs细胞周期调控基因ClnD1、P21wafl表达水平的变化.结果μg水平的SPARC能有效抑制ADPKD CLECs增殖(P＜0.01),使细胞周期停滞于G0/G1期.10μg/ml SPARC刺激后,ClnD1 mRNA水平(3.56±0.54)×104拷贝/百万GAPDH较对照组(7.50±0.99)×104显著减弱,P21WaflmRNA水平(7.72±0.85)×103较对照组(4.25±1.38)×103显著增强.结论SPARC能够有效抑制CLECs细胞周期的进展.其机制可能通过抑制ClnD1、促进P21Wafl的表达,抑制细胞通过G1-S期限制点,从而对其增殖产生显著的抑制作用.
关键词： 常染色体显性多囊肾 细胞周期 富含半胱氨酸的酸性分泌糖蛋白 -
肝细胞生长因子与多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖的关系
目的研究重组人肝细胞生长因子(rhHGF)对常染色体显性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞增殖的影响及其信号转导途径.方法3H-TdR掺入法研究rhHGF对细胞增殖的影响.Western印迹检测囊肿衬里上皮细胞c-MET酪氨酸激酶磷酸化.结果rhHGF显著促进ADPKD囊肿衬里上皮细胞增殖,以1 ng/ml rhHGF作用48h组强(P＜0.01).抗HGF抗体、genistein显著抑制rhHGF刺激的囊肿衬里上皮细胞增殖(P＜0.01),抗TGF-β1抗体不影响rhHGF刺激的囊肿衬里上皮细胞增殖(P＞0.05).rhHGF作用的囊肿衬里上皮细胞c-MET酪氨酸激酶磷酸化呈时间相关性.抗HGF抗体不诱导c-MET酪氨酸激酶磷酸化.结论rhHGF显著刺激囊肿衬里上皮细胞增殖,HGF和c-MET结合激活c-MET酪氨酸激酶磷酸化以及细胞内pp60c-src可能参与了rhHGF促囊肿衬里上皮细胞增殖的信号转导过程.
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肝细胞生长因子及其受体在常染色体显性多囊肾病囊肿衬里上皮细胞的表达研究
目的研究常染色体显性多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞中肝细胞生长因子(HGF)及其受体c-MET的分布.方法采用酶联免疫(ELISA)法测定ADPKD患者囊肿液、血清和原代培养ADPKD囊肿衬里上皮细胞上清液中HGF浓度.逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)、原位杂交、Western印迹、免疫组织化学及计算机图像定量分析HGF、c-MET mRNA和蛋白在囊肿衬里上皮细胞的表达.结果ADPKD未透析患者囊液中HGF浓度为(8.61±0.07)ng/ml,显著高于血清HGF浓度(0.26±0.05)ng/ml(P＜0.01).原代培养的囊肿衬里上皮细胞上清液中也检测到HGF,浓度为(1.43±0.01)ng/ml.体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞中c-MET mRNA含量(75.69±12.36)与HGF mRNA含量(79.89±11.58)呈正相关(r＝0.54,P＜0.01).ADPKD囊肿组织中囊肿衬里上皮细胞c-MET mRNA含量(114.75±36.24)与HGF mRNA含量(136.48±39.69)呈正相关(r＝0.50,P＜0.01).ADPKD囊肿组织中囊肿衬里上皮细胞c-MET蛋白含量(101.68±21.06)与HGF蛋白含量(125.03±19.34)、培养的囊肿衬里上皮细胞c-MET蛋白含量(11.60±1.83)与HGF蛋白含量(18.46±1.71)均呈正相关(r＝0.51,P＜0.05;r＝0.67,P＜0.01).结论ADPKD囊肿衬里上皮细胞可合成和分泌HGF.HGF可调节囊肿衬里上皮细胞表达c-MET.
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上海市汉族人群中与PKD2基因紧密连锁的三个微卫星DNA的多态性研究
目的研究与PKD2基因紧密连锁的3个微卫星DNA D4S1534、D4S1542、D4S423在上海地区汉族人群中的多态性,为常染色体显性遗传性多囊肾病的基因诊断奠定基础.方法采用聚合酶链反应-毛细管电泳-基因扫描方法,对80名无亲缘关系的上海市汉族志愿者进行了上述3个微卫星DNA遗传多态性的分析.结果在上述人群中,发现D4S1534、D4S1542和D4S423分别有9、4和12种等位基因片段,其长度分别在144～160 bp、211～217 bp和103～125 bp之间,杂合度和多态信息含量分别为0.862和0.849,0.462和0.448,0.900和0.898,其基因频率分布符合Hardv-Weinberg平衡.结论D4S1534、D4S1542和D4S423在上海市汉族人群中具有较高的多态性,是理想的遗传标记,可用于常染色体显性遗传性多囊肾病的遗传异质性研究及分子诊断.
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肾细胞凋亡与常染色体显性遗传性多囊肾病肾组织缺失的相关研究
目的研究肾细胞凋亡与常染色体显性遗传性多囊肾病(ADPKD)肾组织进行性缺失的关系.方法采用琼脂糖凝胶电泳、电镜和原位末端标记(TUNEL)法、Hoechst 33342染色法测定正常肾组织、ADPKD肾组织和体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞中凋亡DNA片段.对Tunel法结果作定量分析,计算机图象分析ADPKD肾脏CT检查中残余肾组织/囊肿组织截面积比值,与肾功能衰竭程度作相关分析.结果无或有肾功能衰竭的ADPKD肾组织中肾小球、肾小管上皮和囊肿衬里上皮细胞、体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞均发生凋亡.正常肾组织中无细胞凋亡.ADPKD肾组织中平均每10个高倍视野凋亡的肾细胞计数,肾功能正常组(A组,3.60±1.22)与氮质血症期组(B组,8.17±1.56)、终末期肾衰组(C组,17.81±3.15)间比较差异有非常显著性意义(P＜0.01).ADPKD肾组织中凋亡肾细胞数与肾功能衰竭程度显著相关(r=0.95,P＜0.01).ADPKD残余肾组织/囊肿组织截面积比值,A组(2.04±0.32)与B组(0.91±0.03)、C组(0.37±0.09)间比较差异有非常显著性意义(P＜0.01).ADPKD肾功能分期相同组中凋亡肾细胞数与残余肾组织/囊肿组织截面积比值呈负相关(r=-0.90,P＜0.05).ADPKD残余肾组织/囊肿组织截面积比值与肾功能衰竭程度呈负相关(r=-0.80,P＜0.05).结论ADPKD肾组织中,肾细胞凋亡显著增加,这可能是导致正常肾组织逐渐缺失和肾功能进行性损害的机制之一.体外培养的ADPKD囊肿衬里上皮细胞发生凋亡,表明凋亡是ADPKD的一种遗传性细胞异常.
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中药三棱对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖及上皮生长因子受体磷酸化的影响
目的探讨中药三棱对体外培养的常染色体显性遗传多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞增殖及上皮生长因子受体(EGF-R)磷酸化的影响.方法体外培养的囊肿衬里上皮细胞经EGF、三棱作用后,采用Brdu掺入法测定细胞增殖,流式细胞仪测定细胞周期,Western blotting检测EGF-R磷酸化.结果与对照组比较,EGF(2.5～20 ng/ml)可刺激衬里上皮细胞增殖(P＜0.01);与对照血清比较,三棱含药血清(1%～5%)能明显抑制经EGF刺激后的衬里上皮细胞增殖(P＜0.01),阻止细胞从G0-G1期进入G2-M期,其作用效果呈浓度依赖性;三棱含药血清能抑制囊肿衬里上皮细胞EGF-R的磷酸化(P＜0.05).结论 EGF在多囊肾病发病中起促进作用,三棱可能通过对EGF-R磷酸化的干预而达到抑制细胞增殖的作用,从而为延缓多囊肾病的发生与发展提供理论根据.
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羟甲基戊二酰辅酶A还原酶抑制剂对多囊肾病囊肿衬里上皮细胞增殖抑制及其机制的研究
目的探讨羟甲基戊二酰辅酶A(HMG CoA)还原酶抑制剂对常染色体显性遗传型多囊肾病(ADPKD)囊肿衬里上皮细胞的作用及其机制.方法噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖,免疫印迹法检测细胞膜p21ras的表达,免疫细胞化学检测细胞核c-fos、c-iun的表达.结果 ADPKD囊肿衬里上皮细胞经HMG CoA还原酶抑制剂处理后,细胞增殖受到显著抑制(P＜0.01),细胞膜p21ras蛋白表达下调,细胞核c-fos、c-jun的表达显著下降(P＜0.01).结论 HMG CoA还原酶抑制剂能抑制ADPKD囊肿衬里上皮细胞的增殖,其机制可能与抑制细胞内ras蛋白的异戊二烯化并阻断ras介导的信号转导有关.
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和肽素在慢性肾脏病中的研究进展
慢性肾脏病是我国的高发病之一,具有医疗花费大、易合并心血管疾病、导致生活质量下降、病死率高等特点.2012年流行病学调查显示,我国成年人群中慢性肾脏病的患病率为10.8％,据此估计我国现有成年慢性肾脏病患者约1.2亿,而慢性肾脏病的知晓率仅为12.5％[1].及早发现、诊断及预测疾病的进展对于患者预后的改善有巨大帮助.精氨酸加压素(AVP)具有收缩血管、调节水电解质平衡、参与炎性反应等生理功能,其与多种临床疾病包括肾脏疾病相关,但因半衰期短、体外测定困难等因素使其临床应用受到限制.和肽素和AVP有共同前体,且与AVP水平呈正相关,在体内外性质较稳定,检测方法方便可行,逐渐被许多学者用于代替AVP.研究表明,和肽素在慢性肾脏病的诊断和预后评价方面具有一定的临床价值.
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两例常染色体显性多囊肾患者PKD1基因的突变检测
目的 研究两例常染色体显性多囊肾患者的致病原因.方法 对常染色体显性多囊肾患者的多囊肾病1基因(PKD1)3′端单拷贝区进行了聚合酶链反应-变性高效液相色谱(PCR-denaturing high-performance liquid chromatography,DHPLC)分析,并对有异常峰形的PCR产物进行测序.结果 在1例患者中发现第42外显子的C11901A有一个无义突变,导致原丝氨酸3897变为终止密码子;而另一例患者第35外显子的C10737T有一个错义突变,导致原苏氨酸3509变为甲硫氨酸.在正常对照中发现两种同义突变分别为第42外显子的G11824A及C11860 T.结论 用DHPLC和DNA测序方法对两名患者进行PKD1的突变检测中,发现一个新的无义突变、一个错义突变以及两种同义突变.
