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E2F-1基因反转录病毒载体的构建及其对人胃癌细胞MGC-803增殖的影响
目的:通过构建人同源基因E2F-1反转录病毒表达载体,观察E2F-1过表达对胃癌细胞MGC-803增殖的影响.方法:应用基因重组技术将E2F-1基因克隆到反转录病毒载体pLXSN中,并将经酶切和RT-PCR检测正确的重组载体转染PA317包装细胞,收集病毒上清液感染胃癌细胞MGC-803.应用 RT-PCR和Western印迹法检测MGC-803/pLXSN-E2F-1细胞中E2F-1 mRNA和蛋白的表达情况.应用克隆形成实验和MTT法检测细胞的增殖情况.结果:经酶切和RT-PCR检测结果显示,成功构建E2F-1反转录病毒表达载体.与MGC-803和MGC-803/pLXSN组相比, MGC-803/pLXSN-E2F-1组E2F-1 mRNA和蛋白的表达明显上调(P<0.05).MGC-803/pLXSN-E2F-1组的克隆形成率为48%,明显低于MGC-803组的81%和MGC-803/pLXSN组的77%,差异有统计学意义(P<0.01).MGC-803/pLXSN-E2F-1组的细胞增殖率明显慢于MGC-803组和MGC-803/pLXSN组(P<0.01).结论:成功构建了E2F-1基因过表达的反转录病毒表达载体,并将其成功感染MGC-803细胞,E2F-1过表达可抑制MGC-803细胞的增殖.
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反转录病毒介导的HPV16 E6-siRNA对SiHa细胞增殖及抗药性的影响
目的:探讨反转录病毒介导的靶向人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV)16 E6基因的小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)对HPV16阳性宫颈癌SiHa细胞的影响.方法:收集产反转录病毒PA317细胞的病毒上清液感染SiHa细胞,G418筛选获得HPV16 E6基因稳定沉默的细胞克隆(SiHa/16E6),同时设立载体对照(SiHa/pSUPER)和正常细胞对照(SiHa).RT-PCR检测HPV16 E6和E7 mRNA的表达水平,Western印迹法检测p53、Rb、caspase 3及其底物多聚ADP-核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase,PARP)蛋白的表达,MTT法检测细胞的增殖活性及细胞对顺铂的敏感性.结果:感染后与SiHa细胞对照组相比,各时间点的E6和E7 mRNA表达水平均有所下降,p53和Rb蛋白表达水平增高,caspase-3和PARP剪切后的活性条带增加,感染后40 d细胞的增殖活性下降;在同一药物浓度下,感染后20 d的细胞存活率显著降低,顺铂的IC50值为(3.92±2.48) μg/mL.而SiHa/pSUPER组与SiHa细胞对照组相比,差异无统计学意义.结论:反转录病毒介导的HPV16 E6-siRNA可有效沉默SiHa细胞中E6和E7基因的表达,抑制细胞增殖,并提高细胞对顺铂的敏感性.
