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巨细胞病毒的模式识别受体研究进展
人类巨细胞病毒(HCMV)属疱疹病毒β亚科,为线状双链DNA病毒,在世界范围内普遍感染.在免疫正常的个体,CMV感染大多表现为无症状或亚临床型感染,但在一些免疫低下或免疫抑制人群如胎儿、婴儿、免疫功能不全或缺陷个体则可引起严重疾病.病毒入侵机体,天然免疫应答在第一时间做出反应.天然免疫应答之所以能如此迅速的做出反应,主要依赖细胞表面的模式识别受体.模式识别受体通过识别病毒的病原相关分子模式(如病毒蛋白、核酸),从而引起细胞内信号通路的激活,终引起转录因子的活化,进而使I型干扰素和炎性因子表达增加,产生免疫和炎性反应.天然免疫是机体抵抗病原微生物入侵的第一道防线,病毒有效的复制首先要躲过天然免疫应答的清除,而病毒感染的终结局取决于宿主与病毒之间的“力量”角逐.机体多种天然模式识别受体能够识别巨细胞病毒,从而启动机体的天然免疫应答,发挥抗病毒的效应.
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血管紧张素Ⅱ和高糖环境对大鼠肾小球系膜细胞Toll样受体4信号通路及炎性因子表达的影响
目的 探讨高糖条件下肾小球系膜细胞Toll样受体4(TLR4)及其信号通路中下游因子MyD88、核因子-κB(NF-κB)以及炎性因子的表达变化,论证高糖环境下血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与TLR4的对话关系,以期阐明TLR4信号通路在糖尿病肾病(DN)发病机制中的作用.方法 设计3对针对大鼠TLR4基因的特异性siRNA片段以及带有绿色荧光的阴性对照,筛选出转染效率高的siRNA,用于后续实验.第1部分实验在高糖的基础上分别加入AngⅡ、TLR4siRNA、血管紧张素Ⅱ受体阻断剂(ARB)、阴性对照siRNA,探讨高糖对各组细胞TLR4、MyD88及NF-κB表达的影响;第2部分实验在AngⅡ的基础上分别加入高糖、TLR4 siRNA、ARB、阴性对照siRNA,探讨AngⅡ对各组细胞TLR4,MyD88及NF-κB表达的影响.采用荧光定量PCR检测各组TLR4、MyD88 mRNA的表达,Western blot检测TLR4、MyD88及NF-κB蛋白表达水平的变化,ELISA法检测细胞上清液中白细胞介素-6(IL-6)及单核细胞趋化因子-1(MCP-1)的表达情况.结果 高糖及AngⅡ都可以上调TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及TLR4、MyD88 mRNA的表达水平(均P＜0.05),也可上调IL-6及MCP-1的表达(均P＜0.01)且二者协同刺激情况下上调更明显.siRNA干扰及ARB可下调TLR4、MyD88、NF-κB蛋白及TLR4、MyD88 mRNA的表达,下调IL-6及MCP-1的表达,与高糖及AngⅡ组相比差异有统计学意义(均P＜0.05).结论 高糖环境和AngⅡ刺激系膜细胞TLR4/MyD88信号通路激活,特异性TLR4 siRNA基因可以部分阻断由高糖及AngⅡ诱导的TLR4信号的激活,厄贝沙坦也可部分阻断TLR4信号通路,高糖和AngⅡ共刺激增强由TLR4介导的天然免疫炎症效应,TLR4/MyD88信号通路在此效应中扮演重要角色;TLR4 siRNA基因沉默技术为寻找DN的治疗方法提供了新思路,也为临床上使用ARB延缓DN进程提供了新的理论依据.
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高糖和血管紧张素Ⅱ对人肾小管上皮细胞Toll样受体4信号表达及炎性和纤维化因子的影响
目的 通过研究高糖和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)环境下人肾小管上皮细胞Toll样受体4(TLR4)表达及其相关的炎性和纤维化因子的变化及TLR4 siRNA的干扰作用,从天然免疫角度探讨糖尿病肾病(DN)发病机制和靶向干预措施.方法 设计并合成3对针对人TLR4基因的特异性siRNA片段,以带有红色荧光的BLOCK-IT Alexa Fluor作为阴性对照,荧光显微镜下观察细胞转染效率,实时定量PCR检测TLR4 mRNA的表达变化.确定TLR4 siRNA基因沉默效果较佳后再进一步实验.实验分2部分进行,第1部分细胞分3组:正常糖对照组(NG,5.5 mmol/L葡萄糖)、甘露醇组(M,5.5 mmol/L葡萄糖+19.5 mmol/L甘露醇)和高糖组(HG,25 mmol/L葡萄糖),初步验证高糖、高渗的影响.第2部分7组:NG组、HG组、AngⅡ(10-7 mmol/L)组、AngⅡ+空载体对照组、HG+空载体对照组、AngⅡ+TLR4 siRNA转染组及HG+TLR4 siRNA转染组.采用实时定量PCR法检测TLR4、髓样分化因子88(MyD88)、热休克蛋白47(HSP47) mRNA的表达;Western印迹法检测TLR4、MyD88、HSP47、核因子κB(NF-κB)、Ⅳ型胶原蛋白(ColⅣ)的蛋白表达;ELISA法检测细胞上清液单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)、白细胞介素6(IL-6)的水平.结果 与NG组比较,甘露醇组TLR4、MyD88蛋白表达差异均无统计学意义(P＞ 0.05);HG、AngⅡ组TLR4、MyD88、HSP47 mRNA及TLR4、MyD88、NF-κB、HSP47、ColⅣ蛋白表达均显著上调(P＜0.01),细胞上清液MCP-1、IL-6水平亦升高(P＜0.01);TLR4siRNA转染后,与HG组或AngⅡ组相比上述指标均显著下调(P＜0.01);空载体转染后,与HG组或AngⅡ组相比上述指标差异无统计学意义(P＞0.05).结论 高糖或血管紧张素Ⅱ均刺激人肾小管上皮细胞TLR4信号并引起天然免疫应答,导致炎性和纤维化因子上调.特异性基因沉默可通过阻断由高糖或AngⅡ诱导的TLR4信号,下调炎性及纤维化因子释放.TLR4信号可能是高糖或高肾素环境下人肾小管上皮细胞天然免疫应答的共同关键通路.
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单纯疱疹病毒Ⅱ型诱导人宫颈上皮细胞上调细胞的自噬活性和表达水平的作用
目的 探讨单纯疱疹病毒Ⅱ型(HSV-2)诱导人宫颈上皮(HCE)细胞上调细胞的自噬活性和表达水平的作用.方法 实验分为HSV-2感染组、HSV-2瞬转组及不加病毒处理的对照组,通过Western blot分析、直接免疫荧光、间接免疫荧光、质粒DNA的转染等方法研究HCE细胞在正常培养条件下的自噬活性、HSV-2感染HCE细胞的自噬活性水平及激活自噬则使HCE对HSV-2感染诱导的白细胞介素-6(IL-6)和β干扰素(IFN-β)表达的影响.结果 与HeLa和HEK293T细胞相比,HCE细胞具有高基础水平的自噬;HSV-2感染HCE后进一步诱导上调细胞的自噬活性和表达水平(P＜0.05),并且呈时间依赖性的变化.自噬特异性抑制剂显著降低HSV-2感染所诱导的IL-6和IFN-β的表达(P＜0.05),自噬激活剂则促进HSV-2感染诱导的IL-6和IFN-β的表达(P＜0.05).结论 HCE细胞有着高基础水平的自噬;HSV-2感染HCE细胞早期进一步上调自噬活性水平;HSV-2感染HCE细胞诱导的自噬存在时间依赖性的变化规律;自噬参与了HSV-2感染HCE细胞的天然免疫应答.
