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白细胞介素-21和Blimp1 mRNA在老年类风湿关节炎患者外周血单个核细胞的表达及作用机制
目的 探讨白细胞介素(IL)-21和Blimp1 mRNA在老年类风湿关节炎患者外周血单个核细胞(PBMCs)的表达及作用机制.方法 老年类风湿关节炎患者62例,同期体检的健康老年人45名作为对照.取外周静脉血分离PBMC和血浆,酶联免疫吸附试验(ELISA)法检测血浆中IL-21水平,分析DAS28、抗CCP抗体与IL-21的相关性;实时荧光定量PCR检测患者PBMCs中Blimp1 mRNA表达量;使用IL-21、CD40L刺激PBMCs 72 h后检测Blimp1 mRNA表达量,流式细胞术检测各组CD138+细胞比例.结果 类风湿关节炎患者血浆IL-21含量明显高于对照组(P<0.01).血浆IL-21含量与类风湿关节炎患者DAS28、抗CCP抗体具有明显相关性(r=0.769、0.785,P<0.05).类风湿关节炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表达量明显高于对照组(P<0.05).IL-21、CD40L体外刺激后,对照组与CD40L组Blimp1 mRNA表达水平之间差异无统计学意义(P>0.05);IL-21组、IL-21+CD40L组Blimp1 mRNA表达水平均明显高于对照组(P<0.01);IL-21+CD40L组明显高于IL-21组(P<0.05).流式细胞术显示,IL-21+CD40L组CD138+细胞比例明显高于CD40L组和IL-21组(P<0.05).结论 IL-21可促进老年类风湿关节炎患者PBMCs中Blimp1 mRNA表达,IL-21与CD40L协同作用可通过调节Blimp1 mRNA表达促进B淋巴细胞分化并参与类风湿性关节炎的发病.
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Blimp1基因突变影响其编码蛋白转录抑制功能的体外研究
目的:探讨Blimp1基因突变在弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)发病中的作用.方法:应用基因测序方法检测1例DLBCL患者Blimp1基因的突变情况；用PCR扩增其Blimp1全长编码基因并通过定点突变获得野生型Blimp1的全长编码基因.分别将野生型、突变型Blimp1的全长编码基因亚克隆至含有Flag标签的Flag-CMV4真核表达载体中,将重组质粒分别命名为Flag-Blimp1-wt和Flag-Blimp1-mut;采用PCR扩增获得人CIITA启动子,并将扩增片段插入PGL3-Basic荧光报告基因载体中,所有重组质粒均通过酶切鉴定并测序验证序列正确；将Flag-Blimp1-wt/mut分别与PGL3-CIITA-promoter共转染293T细胞,用荧光素酶报告基因系统检测报告基因载体的活性及Blimp1基因对其表达的调控,采用蛋白印迹法检测融合蛋白Flag-Blimp1-wt与Flag-Blimp1-mut的蛋白表达差异.结果:成功构建野生型、突变型Flag-Blimp1融合蛋白表达载体及PGL3-CIITA-promoter报告基因载体；经荧光素酶报告基因检测系统证实,构建的报告基因载体具有启动子活性,野生型Blimp1蛋白对其表达具有抑制作用,且该抑制作用与Blimp1的转染剂量呈正相关,而突变型Blimp1对其抑制功能明显减弱；蛋白印迹检测结果显示,突变型Blimp1蛋白明显低于野生型.结论:该例患者中Blimp1的突变影响了其转录抑制功能,可能是由基因突变导致Blimp1蛋白表达量的减少所引起.
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小鼠iPS细胞具备诱导性原始生殖细胞分化潜能的研究
目的:探讨小鼠诱导性多能干细胞IP14D-1是否具备诱导性原始生殖细胞(induced primordial germ cells,iPGCs)分化潜能,以及特异基因表达变化及可能机制.方法:未分化IP14D-1培养扩增,分化形成诱导性拟胚体(induced embryoid bodies,iEBs).RT-PCR和免疫荧光分别检测4、7、9d的iEBs中Lin28、Blimpl、Stra8和Mvh的表达变化和蛋白定位情况.结果:未分化IP14D-1同小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells,mESCs)相同,Lin28表达较弱,Blimp1表达相对较强,Mvh和Stra8也在这两种细胞及其相应iEBs和Ebs中表达,但均无明显差别.IP14D-1分化形成的iEBs从4d生长到7d时,Lin28表达逐渐增强,到9d时表现为下降,Blimp1表达则随着iEB生长时间延长而逐渐降低.结论:建立了IP14D-1和相应拟胚体(iEBs)的完善、稳定的培养及分化体系；未分化IP14D-1与mESCs在Lin28、Blimp1、Mvh和Stra8表达方面无明显差别；iEB和Ebs的Mvh和Stra8表达也无明显差别.IP14D-1及iEBs具有iPGCs分化潜能,且可能是7d的iEBs内iPGCs分化数量较多,之后进入iPGCs分化的Lin28低表达时期.
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Blimp1-BCMA调控浆细胞功能在系统性红斑狼疮发病中的意义
目的 探讨Blimp1在MRL/lpr狼疮鼠中的表达水平,为靶向浆细胞治疗SLE提供思路.方法 用EMSA和CHIP证实Blimp1对B细胞成熟抗原(BCMA)的调控作用,并用实时定量PCR检测MRL/lpr狼疮鼠与正常鼠脾脏和淋巴结中Blimp1 mRNA的表达差异.结果 Blimp1能与BCMA基因启动子相结合.狼疮鼠组脾脏Blimp1mRNA的相对表达水平高于正常对照组Blimp1 mRNA的相对表达水平(Z=2.609,P＜0.01),狼疮鼠组淋巴结中Blimp1的相对表达水平也高于正常对照组Blimp1 mRNA的相对表达水平(Z=3.402,P＜ 0.01),差异有统计学意义.结论 BCMA可能是Blimp1的靶基因,Blimp1可直接调控BCMA表达,在维持浆细胞存活及抗体分泌中发挥作用.
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RNA干扰BLIMP1表达对NCI-H929细胞增殖凋亡的影响及可能机制
目的 探讨RNA干扰B淋巴细胞诱导成熟蛋白(B lymphocyte induced maturationprotein,BLIMP1)表达对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞株NCI-H929生物学功能的影响及其可能机制.方法 用慢病毒干扰载体及阴性对照载体转染NCI-H929细胞后采用RT-PCR及Western blot方法观察BLIMP1 mRNA及蛋白表达,CCK-8法检测细胞增殖作用,Annexin V/PI双染色流式细胞术检测细胞凋亡,RT-PCR及Western blot检测未折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR)信号通路中X盒结合蛋白1(X-box binding protein 1,XBP1)、肌醇必需酶(inositol-requiring enzyme,IRE)1α及凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的变化.结果 BLIMP1 shRNA转染NCI-H929细胞后,BLIMP1 mRNA、蛋白表达均下调(P<0.05);shRNA/BLIMP1组24、48及72 h细胞增殖率低于转染空载体(shRNA/con)组和对照组(P<0.05),shRNA/BLIMP1组细胞凋亡率〔(10.87±1.79)%〕高于shRNA/con组〔(5.57±0.87)%〕和对照组〔(4.90±0.57)%〕(P<0.01);凋亡蛋白CHOP表达上调,XBP1、IRE1α表达下调.结论 沉默BLIMP1可以下调XBP1的表达而抑制UPR反应,发挥其抑制NCI-H929细胞增殖及促进凋亡作用.
