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去抗原牛松质骨支架复合骨形态发生蛋白2基因在骨缺损修复过程中的血管化反应
背景: 体外建的组织工程骨是细胞与材料的复合体,再血管化是组织工程骨植入体内后关系其能否充分发挥成骨作用,有效修复骨缺损的关键环节.目的: 观察以去抗原牛松质骨支架复合骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)基因修复大段骨缺损过程中对血管化的影响.设计、时间及地点: 随机分组设计、对照动物实验,于2003-09/2004-12在吉林大学中日联谊医院中心实验室完成.材料: 选用清洁级新西兰大耳白兔60只.选取市售新鲜牛肱骨上端松质骨制备去抗原牛松质骨支架(Bovine Cancellous Bone, BCB).携带人BMP-2和β-半乳糖酐酶基因的重组腺病毒(Ad-BMP-2和Ad-Lacz)及重组人BMP-2(rh-BMP-2)由美国Dr. Oliver及吉林大学病理教研室高航博士馈赠.方法: 新西兰大耳白兔60只分离培养兔骨髓基质干细胞,经BMP-2腺病毒载体转染后复合BCB移植修复兔双上肢桡骨1.5cm的缺损.按随机数字表法分为5组,每组12只,植入经不同处理的人工骨,Ad-BMP-2转染细胞+BCB组,未转染细胞+rh-BMP-2+BCB组,Ad-Lacz转染细胞+BCB组,未转染细胞+BCB组,单纯BCB组.通过紧密缝合肌膜和筋膜固定移植骨.主要观察指标: 术后4,8,12周x射线检查观察骨缺损区的新骨形成情况,微血管墨汁灌注观察血管分布情况,透射电镜观察成骨细胞和血管生成情况,苏木精-伊红染色、爱辛蓝染色和VonKossa染色观察微血管与骨形成关系,血管内皮生长因子免疫组织化学染色测定染色灰度值、CD34免疫组织化学染色特性标记血管内皮细胞,进行微血管计数.结果: 纳入兔60只均进入结果分析.X射线检查和组织学观察显示AD-BMP-2转染细胞+BCB组和未转染细胞+rh-BMP-2+BCB组骨形成及血管生成情况优于其他3组.微血管墨汁灌注显示术后4周,组每一个骨小梁孔隙中有一支新形成的小血管,骨间血管的密度在周边区域较高,随着向移植骨中央呈向心性少.透射电镜观察,组术后4周,可见较多功能活跃的成骨细胞及新生血管芽;术后12周,成熟的板层骨形成,新生血管结完好.血管内皮生长因子表检测和微血管计数测定显示AD-BMP-2转染细胞+BCB组血管内皮生长因子相对含量明显高于其他各组,差有显著性意义(P<0.01).微血管计数明显高于其他各组,差有显著性意义(P<0.01).结论: BMP-2基因可通过上调血管内皮生长因子表,间接诱导移植骨血管化,比应用rh-BMP-2更有优势.
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成骨因子 BMP-2/Smads/Runx2信号转导通路
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)-2在骨形成过程中起着重要作用, BMP-2与多种细胞因子形成信号通路,促进成骨性细胞分化和骨细胞外基质合成与分泌。在骨形成过程中, BMP-2也作为启动调节因子促进新骨形成。该文就骨形态发生蛋白重要信号通路 BMP-2/ Smads/ Runx2与骨发生发育的研究进展作一综述。
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雷公藤多苷对强直性脊柱炎患者成纤维细胞中BMP-2表达的影响
目的：探讨雷公藤多苷（LGTDG）对骨形态发生蛋白（BMP）信号转导通路及 BMP-2表达的影响，阐明 LGTDG抗强直性脊柱炎（AS）骨化的作用机制。方法：体外培养的 AS成纤维细胞分为对照组与0.5、1.0、1.5和2.0 mg · L－1给药组，检测各组细胞内碱性磷酸酶（ALP ）活性及佳药物浓度；CCK-8法检测1.0 mg· L－1给药组的细胞增殖率；生化检测法定量检测对照组与1.0 mg · L－1给药组 BMP-2表达水平；Western blotting法检测对照组与1.0 mg·L－1给药组BMP-2和Cbfal蛋白表达。结果：各给药组细胞中ALP活性均低于对照组，其中以1.0 mg·L－1给药组细胞的ALP活性为低（P＜0.01）。CCK-8法检测，1.0 mg·L－1给药组 AS成纤维细胞增殖率明显低于对照组（P＜0.01）， LDTDG诱导第4天细胞增殖率高，进入平台期后细胞的增殖率开始下降。生化检测法和 Western blotting法检测，1.0 mg·L－1给药组BMP-2的蛋白表达明显低于对照组（P＜0.01）。结论：LGTDG通过对BMP信号转导通路的影响有效地抑制 AS成纤维细胞内 BMP-2表达，延缓细胞向成骨型分化导致 AS骨化发生。
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重组人胶原绑定骨形态发生蛋白2在大肠杆菌中的表达、纯化与复性
目的：利用大肠杆菌表达体系制备带有胶原结合结构域（CBD）的骨形态发生蛋白2（BMP2），研究CBD-BMP2表达、纯化及复性的条件和方法。方法：将具有胶原结合能力的CBD基因序列克隆入 BMP2基因序列的 N端，构建重组蛋白表达质粒 pet21b／CBD-BMP2，转化入工程性大肠杆菌 BL21菌株内；37℃条件下添加诱导剂异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）持续诱导表达；采用 Ni-NTA亲和层析柱进行纯化；运用超纯水稀释复性法对纯化后的CBD-BMP2进行复性；0.22μm微孔滤膜对复性后蛋白除菌，通过除菌前后蛋白浓度比值计算回收率；聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）检测重组蛋白表达、纯化以及复性；BCA蛋白定量法测定蛋白浓度。结果：重组质粒 pet21 b／CBD-BMP2在工程性大肠杆菌中得到充分表达；CBD-BMP2以包涵体形式表达；SDS-PAGE分析，8 mol·L－1尿素存在条件下目的蛋白溶解于裂解液上清中，经纯化后目的蛋白单体存在于洗脱液B中，单体相对分子质量约为14000；稀释复性后SDS-PAGE分析，相对分子质量14000及28000处可见2条清晰条带，重组蛋白单链成功复性为二聚体结构，相对分子质量约为28000；过滤除菌前后目的蛋白浓度分别为110和80 mg·L－1，回收率约为73％。结论：重组CBD-BMP2载体成功转化至大肠杆菌内，CBD-BMP2蛋白得到了高效的表达和复性。建立了利用原核表达体系制备重组CBD-BMP2蛋白的实验方法。
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伤科接骨片联合桃红四物汤对胫腓骨骨折的疗效及对骨形态发生蛋白2与成纤维细胞生长因子b的影响
目的：观察伤科接骨片单用及与桃红四物汤联用对胫腓骨骨折患者骨痂生长情况、骨折部位疼痛情况及消肿时间的影响，并探讨其促进骨骼愈合的机制。方法选择医院收治的胫腓骨骨折患者90例，随机分为 A 组（对照组）、B 组（伤科接骨片组）和 C 组（伤科接骨片+桃红四物汤组），各30例，观察不同时点的骨痂生成情况、疼痛程度及消肿时间，检测血骨形态发生蛋白2（BMP -2）、成纤维细胞生长因子 b（bFGF）的含量，并对结果进行分析。结果治疗4，6，8周的骨痂生长综合评分，B 组、C 组均高于 A 组（ P <0.05）；治疗4，6周的骨痂生长综合评分，C 组高于 B 组（ P <0.05）。治疗3，5，7，9 d，B 组、C 组与 A 组比较，患者疼痛程度均减轻（ P <0.05）；治疗5，7 d，C 组疼痛减轻程度优于 B 组（ P <0.05）。治疗后 B 组、C 组与 A 组比较，患者消肿时间更短（ P <0.05），且 C 组优于 B 组（ P <0.05）。治疗2周后，B 组、C 组血清中 BMP -2及 bFGF 的含量比 A 组更高（ P <0.05）。结论伤科接骨片能促进胫腓骨骨折患者骨痂生长，减轻疼痛，缩短消肿时间，发挥促骨骼生长作用，伤科接骨片联合桃红四物汤有协同作用，比伤科接骨片单用效果好，其分子生物学机制是通过增加促骨生长因子 BMP -2及 bFGF 的表达。
