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持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响
背景:骨髓基质干细胞来源的成骨细胞是骨髓腔内主要的受力细胞,在人工关节置换病例中,其生命活动状况与假体传导压力有密切关系.目的:观察持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响.揭示持续压力致假体松动下沉进展及其置换后活动影响的生物学机制.设计、时间及地点:随机分组设计,细胞学体外观察,于2004-02/2007-10在解放军第四军医大学骨科研究所完成.材料:出生1个月的新西兰幼兔1只,体质量0.5 kg,取其骨髓基质干细胞用于实验.方法:传代培养兔骨髓基质干细胞,将生长良好的第3代骨髓基质干细胞按1×104个/孔随机接种于7块24孔培养板,14 h后细胞完全贴壁,换新鲜含体积分数为10%胎生血清的DMEM.实验随机将4块培养板分为4组:对照组不予加压,20 kPa持续压力组,60 kPa持续压力组,100 kPa持续压力组分别在规定的时间内每天施以20,60,100 kPa的持续3 h压力.主要观察指标:四甲基偶氮唑盐法检测培养1,3,5,7 d各组骨髓基质干细胞的吸光度值变化.结果:除培养第1天外,第3,5,7天各压力组骨髓基质干细胞的吸光度值均低于对照组(P<0.01).其中第3天20 kPa持续压力组与60 kPa持续压力组吸光度值差异无显著性意义(P>0.05),但均高于100 kPa持续压力组(P<0.05).第5天不同持续压力组吸光度值两两比较差异具有显著性意义(P<0.05),压力越高,吸光度值越低.第7天100 kPa持续压力组吸光度值低于压力20 kPa持续压力组(P<0.05).结论:关节置换后早期患者不宜过早下地,否则将产生持续性应力,可以引起骨髓腔内骨髓基质干细胞的抑止,从而不利于骨质愈合,容易产生假体下沉和松动.
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持续性压力通过影响ERK1/2和GIT1的结合促进大鼠成骨细胞的迁移
目的:探讨持续压力对体外培养的大鼠成骨细胞内ERK1/2及GIT1蛋白相互关系及对大鼠成骨细胞迁移能力的影响.方法:取1～2天龄SD大鼠颅盖顶骨进行成骨细胞原代培养,采用压缩空气在密闭容器内对第2代细胞施以300 kPa的静压力,分别于未加压,加压后0.5、1.0、2.0 h提取细胞总蛋白,Western blot检测各组成骨细胞在Src抑制剂PP2不干预和干预下ERK1/2和GIT1的表达及其磷酸化,免疫共沉淀分析GIT1同活化的ERK1/2(phospho-ERK1/2,pERK1/2)相互作用的变化.Image-Pro Plus 5.0软件检测成骨细胞在Src抑制剂PP2不干预和干预下加压前后面积.结果:Western blot结果显示pERK1/2和pGIT1的表达在持续加压组较对照组明显增加;PP2干预下持续加压组的成骨细胞内的pERK1/2和pGIT1的表达较对照组无统计学差异;免疫共沉淀结果显示GIT1-pERK1/2结合力在持续加压组较对照组明显增加;持续加压后成骨细胞面积明显增加:PP2干预下持续加压后成骨细胞面积较对照组无统计学差异.结论:300 kPa左右的持续性压力能通过激活Src的活性,从而诱导ERK1/2,GIT1的磷酸化,同时增加pERK1/2和GIT1的相互结合,促进大鼠成骨细胞的迁移,Src-GIT1/ERK1/2途径可能是成骨细胞力学信号转导过程中的重要通路之一.
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持续性压力促进成骨细胞分泌VEGF的机制
目的:探讨持续性压力促进成骨细胞分泌血管内皮生长因子(VEGF)的机制.方法:取1～2日龄SD大鼠颅盖骨进行成骨细胞原代培养,检测并鉴定成骨细胞.细胞培养至第3代,分为加压组和不加压组,每组再分成PD98059不预处理组和预处理组.加压组在密闭容器内采用压缩空气施以100 kPa的静压力,分别加压0.5、2.0、6.0 h,ELISA法检测培养液中VEGF浓度,RT-PCR检测VEGF mRNA的变化；Western blot检测各组成骨细胞内磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的水平.结果:持续性压力促进成骨细胞VEGF mRNA的表达和蛋白的分泌,同时也明显增加ERK1/2的磷酸化水平；而ERK1/2总蛋白的量却无明显变化.PD98059在显著抑制持续性加压所诱导的成骨细内ERK1/2磷酸化水平的同时,抑制了VEGF的表达及分泌.结论:持续性压力通过ERK1/2的激活调节成骨细胞VEGF的分泌.
关键词： 持续性压力 细胞外信号调节激酶1/2 血管内皮生长因子 -
持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响
[目的]探讨持续性压力培养环境对兔骨髓基质干细胞增殖的影响,揭示持续压力致假体松动下沉进展及其术后活动影响的生物学机制.[方法]以新西兰兔的骨髓基质干细胞为实验材料,通过四唑盐(MTT)比色试验,观察压力对骨髓基质干细胞增殖的影响.[结果]骨髓基质干细胞在20、60、100 kPa持续性压力培养环境下MTT反应的OD值显著小于对照组,压力值越大,OD值越小.20、60、100 kPa持续性压力可显著抑制骨髓基质干细胞细胞增殖,抑制作用随压力值增大而增强.[结论]关节置换术后早期患者不宜过早下地,否则将产生持续性应力,可以引起骨髓腔内骨髓干细胞的抑制,不利于骨质愈合.且易产生假体下沉和松动.
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两种间歇性压力对兔后肢压力性溃疡形成的影响
目的 通过两种间歇性压力作用于兔后肢形成压力性溃疡的比较,探讨波浪床产生的渐变间歇性压力预防压力性溃疡的机制. 方法 成年日本大耳白兔12只,于两侧后肢3 cm2大小股薄肌部位随机给予渐变间歇性压力(50～160 mm Hg,1 mm Hg=0.133 kPa)和持续性压力(100 mm Hg)作为实验组和对照组.施压2 h,去除压力30 min为1个周期,重复4个周期.在施压前及各周期去除压力间歇中的每隔10 min(0、10、20、30 min),使用双向多普勒血流探测仪和激光多普勒血流灌注成像系统探测两组后肢血流速度和创面血流灌注.施压完成后大体观察创面情况,于受压部位取材,HE染色观察;比色法测定受压肌肉组织匀浆中NO、丙二醛(maiondialdehyde,MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量. 结果 施压前两组血流速度差异无统计学意义(P>0.05);每个周期0 min时两组血流速度均显著下降,但两组间差异无统计学意义(P>0.05);实验组于10、20、30 min时血流速度均较对照组高(P<0.05).施压前两组创面血流灌注差异无统计学意义(P>0.05),每个周期0 min时两组创面血流灌注均显著下降,但两组间差异无统计学意义(P>0.05);第1个周期10 min时,两组差异无统计学意义(P>0.05),20、30 min时实验组高于对照组(P<0.05);之后3个周期实验组创面血流灌注较对照组恢复快(P<0.05).大体观察可见实验组创面渗出较对照组少,镜下见无明显溃疡形成,皮肤附属器完整,炎性细胞浸润少;对照组皮肤存在明显溃疡,皮肤附属器缺失,较多炎性细胞浸润.两组NO、MDA及SOD含量比较,差异均有统计学意义(P<0.05). 结论 渐变间歇性压力可以维持组织血流灌注,减轻缺血再灌注损伤,减少细胞凋亡,预防压力性溃疡的形成.
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三维重建胫骨前肌在评估两种压力模式对大鼠深部组织损伤中的应用
目的 应用大鼠受压胫骨前肌连续切片获得的二维图像进行整体及损伤区三维重建,定量评估两种压力模式下的压力-损伤效应.方法 取10～12周龄SD大鼠20只,雌雄不限,体重280～300g,随机分为实验组及对照组(n=10).于一侧后肢取0.12 cm2大小胫骨前肌部位,实验组给予间歇渐变性压力8.0～21.3 kPa,对照组给予持续性压力13.3kpa.每施压2h间歇30min为1个周期,重复3个周期后终止施压,观察大鼠一般情况.于施压完成后24h大体观察受压部位皮肤及胫骨前肌,并取材连续4 μm厚切片,HE染色后行二维图像采集,Image Pro Plus 6.0图像采集分析系统进行全景图拼接及坏死、损伤区域轮廓定义划分,Photoshop 8.0.1绘图软件图像配准,输入Mimics 10.1软件进行三维重建,并获得胫骨前肌、损伤区三维图像及各自体积、表面积.结果 两组动物均存活至实验完成,施压完成后24 h时皮肤均无溃疡发生,受压皮肤和胫骨前肌均有不同程度水肿及压痕,其中对照组皮肤出现不褪色红斑.两组胫骨前肌标本共获994个切面,三维重建显示对照组损伤较明显,范围广且穿透于整个胫骨前肌,并沿胫骨骨面分布;实验组损伤区域较小,宽度与施压面积相似.两组胫骨前肌体积和表面积差异无统计学意义(P＞0.05);而对照组损伤区体积和表面积均较实验组大,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 三维重建可评估完整组织内病理变化,为力学性能在受压组织内的分布提供直观依据;与持续性压力比较,间歇渐变性压力可以减少深部组织损伤.
