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RT-PCR法定量分析沙门氏菌中acrA基因mRNA的表达
本试验应用竞争性RT-PCR技术,对9株鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株外输泵acrAB的acrA基因表达的mRNA水平进行了定量检测,从而对耐药菌株外输泵的活动性进行分析.
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改进竞争性RT-PCR法在定量PER1基因表达中的应用
目的研究使用不同样品稀释液及变性高效液相色谱(DHPLC)梯度条件对定量检测PER1基因表达的影响.方法竞争性RT-PCR与DHPLC结合定量检测基因表达.结果样品稀释液中含有载体可极大提高实验的重复性、准确性;不同DHPLC梯度条件对定量结果无明显影响.结论建立定量PER1基因mRNA表达水平的竞争性RT-PCR系统有助于精确检测微量标本中节律基因表达的变化,探寻生物节律与疾病状态间的关系.
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IFN-γ基因对表达DHBV preS/S蛋白质的DNA疫苗诱生免疫应答的影响
目的利用DHBV感染鸭模型,研究鸭IFN-γ真核表达质粒作为免疫佐剂对DNA疫苗诱导免疫应答的影响和预防DHBV感染的作用. 方法用DuIFN-γ真核表达质粒与DHBpreS/S DNA疫苗共免疫,或用DHBpreS/S DNA疫苗单独免疫正常幼鸭,检测经免疫前后鸭PBMC表达DuIFN-γ的mRNA水平(半定量竞争性RT-PCR)、诱生的抗体水平(ELISA)、病毒攻击免疫鸭后血清和肝脏中的病毒DNA变化(斑点和Southern印迹核酸杂交). 结果 IFN-γ表达质粒作为免疫佐剂,可以增强DNA疫苗诱导的鸭PBMC IFN-γ的mRNA表达水平.用大剂量病毒攻击免疫鸭的结果显示,用DuIFN-γ表达质粒和DHBpreS/S DNA疫苗共免疫鸭清除DHBV的速度,明显比仅用DHBpreS/S DNA疫苗免疫鸭清除病毒的速度快,肝脏中DHBV总DNA和共价闭环DNA(cccDNA)的量也低于DHBpreS/S DNA单独免疫组. 结论 IFN-γ真核表达质粒作为免疫调节佐剂在DNA免疫中具有潜在的应用价值.
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多特异性内参照模板的构建及应用
目的:构建多特异性内参照模板,用于Fas、FasL、GB、P、TIA-1和β-actin的竞争性PCR定量.方法:体外合成DNA单链,PCR扩增后,得到2个片段.片段1长145 bp,含有Fas、FasL、GB、P、TIA-1和β-actin的5′引物序列;片段2长147 bp,含有相同基因的3′引物序列.将片段1、2分别克隆在载体PKF3上.结果:克隆载体经酶切鉴定及DNA序列测定,证实为本实验所设计的多特异性内参照模板,以此为模板,用不同的引物进行PCR扩增,即可得到相应的竞争内参照.应用多特异性内参照模板对移植肾急性排斥患者外周血淋巴细胞中TIA-1进行定量,结果显示,底物量在一定范围内,靶序列和竞争性内参照模板的扩增效率基本一致,尤其是在指数期.这一结果同样适用于Fas、FasL、GB、P和β-actin的定量.结论:本实验构建的多特异性内参照模板可用于6种基因的竞争性PCR检测,为进一步研究打下了基础.
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竞争性RT-PCR法定量分析骨巨细胞瘤中TGFβ-1 mRNA的表达水平
目的用竞争性PCR法检测骨巨细胞瘤(GCT)中TGFβ-1mRNA,分析其对肿瘤预后的意义.方法通过RT-PCR法制备内标和外标,将等量的内标和等比稀释的外标进行竞争性共扩增,得到标准曲线,然后将等量的内标和cDNA标本共扩增,通过标准曲线求出标本中TGFβ-1mRNA的水平,并与GCT分级进行对比.结果内标和外标在共扩增中表现出很强的竞争性.GCT中TGFβ-1 mRNA的表达水平随着肿瘤分级的上升明显增加,局部复发和肺转移的标本中TGFβ-1mRNA表达水平较未复发的标本高.结论竞争性RT-PCR是一种灵敏,简便、快速检测GCT中TGFβ-1mRNA表达水平的方法.应用该方法和肿瘤病理分级标准来综合判断肿瘤的预后,有着重要的临床意义.
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外周血单个核细胞IFN-γmRNA的测定及应用
目的研究鸭IFN-γ(DuIFN-γ)在感染及控制病毒过程中的作用和机制.方法基于β-actm的高度保守序列设计引物,通过RT-PCR方法获得了β-actin的部分cDNA为看家基因,然后构建DuIFN-γ靶片段的竞争性内参照,建立检测DuIFN-γ基因转录的半定量竞争性RT-PCR方法.结果建立了检测DuIFN-γ基因转录的半定量竞争性RT-PCR方法,并检测了在PHA刺激下鸭外周血单核细胞IFN-γ mRNA动态变化,结果表明PHA刺激24～36 h,DuIFN-γmRNA转录量高.以此方法对用DHBVpreS DNA或与IFN-γ DNA共免疫DHBV感染鸭进行了测定,结果表明IFN-γ表达质粒作为DNA免疫佐剂,可以增强宿主IFN-γ的应答.结论IFN-γ表达质粒为DNA疫苗的有效佐剂.DuIFN-γ基因转录的半定量竞争性RT-PCR方法为研究鸭IFN-γ在DHBV感染及清除中的作用和机制奠定了基础.
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竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达
目的:建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)基因表达水平的竞争性RT-PCR方法,以研究GPI-PLD与白血病等疾病的关系.方法:首先用PCR 定点诱变法构建GPI-PLD的竞争性cDNA模板,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区,但在长度上要比靶cDNA少20个碱基.把该竞争性cDNA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT-PCR的内标准,与白血病细胞株K562细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开,然后对电泳图像进行光密度扫描,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI-PLD mRNA的量,从而得到GPI-PLD基因的绝对表达量.结果:构建和制备了长度为198 bp的GPI-PLD 竞争性RNA模板,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT-PCR反应;测得K562细胞GPI-PLD基因的表达水平为每纳克(440±20)拷贝.结论:成功地建立了一种定量检测GPI-PLD基因表达水平的竞争性RT-PCR方法,该方法具有灵敏、准确等优点.
关键词： 竞争性RT-PCR 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D 逆转录 白血病 -
人类外周血hPer1基因节律性表达的研究
目的生物节律广泛存在于人类生活和工作中,为研究正常人节律基因表达特点,定量检测正常年轻人外周血中节律基因Per1(human Penod 1,hPer1)的表达.方法实验对象为7名大学生(H1-H7),年龄24～30岁,男性3名,女性4名.其中H7于实验前1天晚上值夜班.分别在09:00,15:00,21:00,03:00,09:00点抽取肘静脉血6 mL,抽提全血总RNA.应用竞争性RT-PCR方法定量检测实验对象外周血中每人每个时间点hPer1基因的表达.结果人类外周血中hPer1基因的表达有显著节律性.表达高峰在09:00而低峰在21:00,两者之间的差异达2.29±0.9倍(P＜0.01),第2天09:00 hPer1基因表达水平又回到高峰.结论 hPer1基因的表达在外周血中存在节律性.
