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RT-PCR法定量分析沙门氏菌中acrA基因mRNA的表达
本试验应用竞争性RT-PCR技术,对9株鸡源性沙门氏菌氟喹诺酮类耐药株外输泵acrAB的acrA基因表达的mRNA水平进行了定量检测,从而对耐药菌株外输泵的活动性进行分析.
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福氏志贺菌主动外排基因acrA的克隆及原核表达
目的 对福氏志贺菌外排基因acrA进行克隆和原核表达,为进一步研究其在志贺菌外排机制中的作用奠定基础.方法 参考福氏志贺菌2a acrA基因序列设计一对特异引物,在引物的5′和3′端分别加入含有BamHⅠ和SalⅠ限制性酶切位点序列.以福氏志贺菌2a菌株基因组DNA为模板,通过PCR扩增acrA基因并与pMD18-T载体连接,然后转化DH5α.提取重组质粒pMD18-acrA,经BamH I/Sal I双酶切并与载体pET30a 连接后转化宿主菌 BL21(DE3)pLys,通过IPTG 诱导表达目的 蛋白.结果 克隆的acrA基因长度为1122bp,核苷酸序列与GenBank上公布的序列完全相同.原核表达经SDS-PAGE 及 Western Blotting 检测和鉴定,结果表明重组载体pET-30a-acrA可成功地在大肠杆菌中表达AcrA蛋白.结论 成功构建了福氏志贺菌acrA基因的原核表达质粒,并在大肠杆菌中得到有效表达,该研究为了解AcrA蛋白的特性、功能以及对福氏志贺菌多药耐药机理的深入研究奠定了基础.
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苦丁茶和小飞扬草对多重耐药性大肠杆菌外排泵acrA基因表达的影响
目的 探讨苦丁茶、小飞扬草水提物对多重耐药性大肠杆菌外排泵acrA基因表达的影响.方法 用纸片扩散法筛选多重耐药性大肠杆菌,试管二倍稀释法检测苦丁茶、小飞扬草水提物和阿莫西林对多重耐药菌株的低抑菌浓度(MIC),用1/2 MIC浓度的苦丁茶、小飞扬草水提物干预多重耐药菌株,72 h后检测阿莫西林的MIC;选取苦丁茶和小飞扬草干预前后的耐药菌株进行荧光实时定量PCR检测外排泵基因acrA mRNA的表达.结果 筛选出3株多重耐药性大肠杆菌,苦丁茶或小飞扬草干预后阿莫西林对多重耐药株的MIC明显低于干预前(P＜0.05);苦丁茶或小飞扬草干预后acrAmRNA的表达量均较干预前明显降低(P＜0.05).结论 苦丁茶和小飞扬草对多重耐药性大肠杆菌有明显抑制作用,其机制可能是与通过降低多重耐药性大肠杆菌外排泵acrA基因mRNA的表达量有关.
