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LRIG2在小鼠胃肠道中的分布特点及其意义
目的 观察富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)在小鼠胃肠道中分布特点,并探讨LRIG2在胃肠动力调控以及胃肠道肿瘤发生中所起的作用. 方法 采用Western blotting检测LRIG2蛋白在成年小鼠胃、小肠、结肠中的表达水平,免疫荧光法检测LRIG2在胃肠道黏膜层、黏膜下层、肌层的分布特点,以及LRIG2在Caja1间质细(interstitial cells of CajaI)、PDGFRα阳性细胞或肠内胶质细胞的表达情况. 结果 LRIG2蛋白在胃、小肠、结肠均有表达,而且表达水平三者差异有统计学意义(P＜0.05);其中结肠高,小肠次之,胃低.肠道切片免疫荧光染色结果提示,LRIG2阳性细胞主要分布于胃、小肠、结肠肌间神经丛;LRIG2阳性细胞在小肠黏膜下层也有分布.肠道全层铺片免疫荧光染色结果提示,LRIG2阳性细胞广泛分布于肌间神经丛中,细胞呈卵圆形,并团簇状紧密排列.肠内胶质细胞并不表达LRIG2,但是包绕于LRIG2阳性细胞周围.LRIG2在Cajal间质细胞以及PDGFRα阳性细胞上也均不表达,但是LRIG2阳性细胞和二者紧密相邻. 结论 LRIG2在胃肠道中分布广泛,并且和胃肠动力以及胃肠道细胞增殖的调控密切相关.LRIG2可能是研究胃肠动力紊乱性疾病以及肠道肿瘤的发病机制的一个新靶点.
关键词： 富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2 胃肠动力 SIP合胞 小鼠 胃肠肿瘤 -
富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2调控血小板源性生长因子受体β信号通路促进胶质母细胞瘤细胞周期进展
目的 探讨富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)调控血小板源性生长因子受体p(PDGFRp)信号通路促进胶质母细胞瘤(GBM)细胞周期进展的机制.方法 免疫组织化学法检测肿瘤组织中蛋白表达;流式细胞术检测细胞周期进展;裸鼠皮下移植瘤模型检测细胞在体成瘤能力;免疫荧光共聚焦及免疫共沉淀检测蛋白结合;Western blot检测信号通路蛋白表达.结果 人GBM组织中LRIG2与PDGFRβ蛋白表达呈正相关(x2=6.411,P＜0.05).PDGF-BB刺激下,LRIG2过表达组S期及G2/M期细胞百分比均明显高于对照组[(22.74±1.23)％比(11.60±0.82)％,t=13.052,P＜0.05;(19.06±1.04)％比(9.36±0.65)％,t=13.699,P＜0.05].裸鼠皮下移植瘤LRIG2过表达组肿瘤体积明显高于对照组[(1372.56±167.88) mm3比(413.34±76.79) mm3,t=11.619,P＜0.05].GBM细胞中LRIG2蛋白与PDGFRp蛋白存在共表达,且存在物理性结合.PDGF-BB刺激下,LRIG2过表达组U87细胞中PDGFRβ、磷酸化PDGFRβ(p-PDGFRβ)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化信号转导与转录激活因子-3(p-STAT3),细胞周期蛋白(Cyclin) B1和Cyclin D1表达水平均明显高于对照组.结论 LRIG2通过调控PDGFRp信号通路促进GBM细胞周期进展.
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RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制
目的 探讨RNA干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因表达后对胶质瘤细胞生长的影响及其机制.方法 用携带U6启动子和LRIG2特异性短发夹RNA(shRNA)序列的质粒载体pGenesi12-LRIG2-shRNA(siRNA)及含非特异性shRNA编码序列的对照质粒pGenesi12-scramble-shRNA(scr)转染胶质瘤细胞系GL15、G418(600mg/L)筛选出稳定株,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot法检测LRIG2和表皮生长因子受体(EGFR)表达的改变.噻唑蓝(MTT)比色法检测稳定转染对照组和实验组细胞的增殖,流式细胞仪检测对照组和实验组细胞的细胞周期改变.结果 实验组细胞LRIG2 mRNA和蛋白水平与对照组比较分别下降了68.6%和62.3%,EGFR蛋白水平下降了32.6%.MTT结果显示实验组细胞增殖率低于对照组.细胞周期分析表明对照组G0/G1期为(26.72±2.10)%,实验组为(36.58±3.29)%(P<0.05),LRIG2表达下调后GL15细胞细胞周期部分阻滞在G0/G1期.结论 GL15细胞经RNA干扰基因表达后,LRIG2 mRNA和蛋白水平明显降低,同时EGFR蛋白水平下降,从而抑制细胞增殖和使细胞周期阻滞在G0/G1期.LRIG2可通过EGFR信号系统影响胶质瘤细胞的生长.
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富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2基因全长及胞外段慢病毒表达载体的构建及对胶质瘤细胞增殖的影响
目的 构建富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2( LRIG2)基因全长及胞外段的慢病毒表达载体并转染人胶质瘤细胞株,观察其对胶质瘤细胞增殖的影响.方法 运用基因重组技术将LRIG2基因全长(LRIG2)和胞外段(LRIG2ecto)片段分别插入慢病毒载体pLVX-Puro-3×Flag；然后用pLVX-Puro-3×Flag-LRIG2和pLVX-Puro-3×Flag-LRIG2ecto分别转染胶质瘤细胞株U87；荧光定量聚合酶链反应(PCR)和Western blot分别检测LRIG2及LRIG2ecto的mRNA和蛋白表达；细胞增殖检测试剂盒( CCK-8)检测转染后细胞的增殖；流式细胞术检测细胞周期.结果 Western blot鉴定Flag标签蛋白表达成功；LRIG2及LRIG2ecto过表达组mRNA表达分别是对照组的8.42和29.58倍(P＜0.01)；LRIG2及LRIG2ecto过表达组细胞增殖率明显高于对照组；LRIG2及LRIG2ecto过表达组细胞增殖指数(PI)分别为(50.63±1.29)％和(48.61±0.55)％,明显高于对照组(45.48±0.72)％ (P＜0.01).结论 成功建立稳定表达外源性LRIG2基因全长及胞外段的人胶质瘤细胞株,且证实均促进胶质瘤细胞增殖.
关键词： 富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2 慢病毒 胶质瘤 细胞增殖 -
LRIG2基因短发夹RNA表达载体的构建、鉴定和稳定株的筛选
目的 构建针对富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因的短发夹RNA(shRNA)表达载体,建立稳定转染的细胞株,观察其对目的 基因表达的影响.方法 根据GenBank中LRIG2基因序列设计2条RNA干扰序列,命名LRIG2-shRNA1、LRIG2-shRNA2,同时设计1条非特异性序列作为阴性对照.据此设计合成各自的寡核苷酸链,退火后连接入pGenesil 2载体,转化扩增后进行序列测定.用不同浓度的G418作用于GL15细胞,得到G418对于GL15细胞的筛选浓度.3种重组表达载体转染胶质瘤细胞系GL15细胞,用G418筛选后挑单克隆后扩增获得稳定株.逆转录RT-PCR和Western印迹法分别在mRNA和蛋白水平上检测LRIG2的表达.结果 3种重组表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-LRIG2-shRNA2和pGenesil 2-negative shRNA)经限制性酶切及DNA测序分析证明序列插入正确.G418对于GLl5细胞的筛选浓度为600μg/ml,筛选出稳定转染三种质粒的GL15细胞,转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA2组细胞LRIG2 mRNA和蛋白表达明显低于转染pGenesil 2-LRIG2-shRNA1、pGenesil 2-negative shRNA组.结论 成功构建了针对LRIG2基因的shRNA表达载体(pGenesil 2-LRIG2-shRNA2),转染细胞后可抑制LRIG2基因表达,为研究LRIG2基因的功能提供了基础.
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干扰LRIG2通过调控PDGFRβ信号通路抑制人胶质母细胞瘤细胞增殖
目的 探讨干扰富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因表达对人胶质母细胞瘤细胞U87增殖的影响及其机制.方法 构建LRIG2干扰(LRIG2sh)及对照(scr)慢病毒载体质粒并感染U87细胞,筛选获得稳定细胞株;CCK8检测细胞增殖及软琼脂克隆形成实验检测细胞克隆形成能力;流式细胞术检测细胞周期;裸鼠皮下成瘤实验检测在体成瘤能力;Western Blotting检测信号通路蛋白表达.结果 LRIG2干扰组中LRIG2 mRNA水平及蛋白表达水平均明显低于对照组,免疫荧光示干扰组中PDGFR β荧光强度明显弱于对照组.PDGF-BB刺激下LRIG2干扰组细胞增殖率明显低于对照组(P＜0.05),且呈浓度和时间依赖性.PDGF-BB刺激下LRIG2干扰组中软琼脂克隆形成能力明显低于对照组,G0/G1期细胞数百分比明显高于对照组,S期及G2/M期细胞数百分比明显低于对照组(P＜0.01).LRIG2干扰组裸鼠皮下成瘤体积和重量明显小于对照组(P＜0.01).PDGF-BB刺激下LRIG2干扰组中pPDGFRβ及其下游pAkt、pStat3表达水平明显低于对照组,且LRIG2干扰后PDGFRβ抑制剂对其信号通路的抑制水平明显减弱.结论 LRIG2下调通过抑制PDGFRβ信号通路抑制胶质母细胞瘤细胞离体和在体增殖,LRIG2有望成为胶质细胞瘤治疗的新靶点.
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LRIG2基因全长及胞外段抑制胶质瘤细胞系U87凋亡的机制
目的 研究富含亮氨酸重复序列免疫球蛋白样蛋白2(LRIG2)基因全长及胞外段抑制胶质瘤细胞系U87凋亡的机制.方法 将LRIG2全长(LRIG2),LRIG2胞外段(LRIG2ecto)及空白对照(Con)慢病毒表达载体分别感染U87,筛选获得稳定细胞株;流式细胞术检测细胞凋亡率及细胞线粒体膜电位;Western blotting检测凋亡相关蛋白及信号通路蛋白表达.结果 LRIG2及LRIG2ecto过表达组细胞凋亡率分别为2.86％±0.30％和4.04％±0.59％,明显低于对照组5.90％±0.45％(P＜0.05);其线粒体膜电位分别是对照组的(2.77±0.25)倍和(2.33±0.17)倍,较对照组明显升高(P＜0.01);其凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值分别是对照组的(1.45±0.09)倍和(1.35±0.08)倍,较对照组明显升高(P＜0.01);其表皮生长因子受体(EGFR),磷酸化EGFR(P-EGFR)及其下游的磷酸化蛋白激酶B (pAkt)均较对照组明显增加.结论 LRIG2基因全长及胞外段均可激活EGFR信号通路,抑制胶质瘤细胞凋亡.
