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空肠弯曲菌粘附蛋白PEB1的克隆表达及免疫保护性初步探索
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, Cj)已成为近年引起腹泻常见病原,而其某些菌株更被证实是诱发格林-巴利综合征(GBS)的主要前驱感染因子.Cj的可溶性蛋白(PEB1)是该菌侵袭肠道的重要致病因子,其抗原性在各个菌株间相对保守[1],使它可望成为Cj疫苗候选抗原成分.
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重组尿素酶B亚单位和黏附素双价疫苗对幽门螺杆菌SS1株感染BALB/c小鼠的免疫保护作用
幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)是人慢性胃炎和胃溃疡的病原菌,并与胃腺癌和胃淋巴瘤的发生有密切关系.接种疫苗是预防Hp感染和控制Hp感染相关疾病为有效的措施,但目前仍无Hp疫苗上市.Hp尿素酶B亚单位(UreB)和黏附素(HpaA)几乎存在于所有Hp临床菌株表面,高度保守且抗原性强.大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及其A亚单位的突变体(LTKA63)和霍乱肠毒素B亚单位(CTB)有较强的免疫佐剂作用.
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结核分枝杆菌CFP10-ESAT6融合蛋白的制备
CFP10和ESAT6都是结核分枝杆菌(M.tb)特有的、有良好抗原性的分泌性蛋白,将其编码基因1hp和esat6用GeneSOEing法通过Linker(Gly4Ser)3构建成融合基因,并克隆入pQE30质粒,表达、纯化、鉴定rCFP10-ESAT6,为其应用于M.tb感染的诊断和预防奠定基础.
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西尼罗病毒外膜蛋白的表达及其抗原性鉴定
西尼罗病毒(West Nile virus,WNV)属黄病毒科、黄病毒属,血清学分类与乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)同属JEV复合组.该病毒主要引起人和哺乳动物的西尼罗热和西尼罗脑炎,是近年来倍受关注的新发虫媒传染病之一[1].WNV基因组核酸为单股正链RNA,由约11 kb核苷酸组成.病毒蛋白包括3种结构蛋白和7种非结构蛋白.其中外膜(E)蛋白是WNV重要的结构蛋白,有较强的免疫原性[2].我国1987年在广西沙田、大路的居民中曾发现WNV抗体阳性者[3],但之后未见相关的研究报道,且缺乏有效的血清学诊断方法.
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4型戊型肝炎病毒ORF2多肽的二聚体特性和抗原性特征
目的 研究4型戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)开放阅读框架2(open readingframe 2,ORF2)编码的多肽二聚体特性和抗原性特征.方法 从患者血清克隆HEV ORF2基因,在大肠杆菌中表达不同长度的ORF2多肽,并表达点突变多肽,纯化后在SDS-PAGE不同条件下分析二聚体特性,同时用Westem blot分析其抗原性特征.结果 由459～607位氨基酸构成的ORF2多肽能形成二聚体,而在氨基端截短13个氨基酸或在羧基端截短13个氨基酸均不形成二聚体,562位天冬酰胺、595位异亮氨酸分别突变后在SDS作用下仅以单体存在.Westem blot显示,抗-HEV仅与二聚体的ORF2多肽反应,而不与单体ORF2多肽或截短肽反应.结论 4型HEV ORF2多肽形成二聚体必须含有459～607位氨基酸,其中562位和595位氨基酸突变能影响二聚体的稳定性.该多肽的抗原性取决于二聚体结构.
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人巨细胞病毒UL57基因原核表达克隆的构建、表达及初步纯化
现有的IgM血清学试验对HCMV的诊断存在敏感性和特异性较差问题，其主要原因是迄今采用的抗原仍为从纯化的病毒颗粒中提取的病毒抗原性物质或粗提的病毒全抗原成分。近几年来人们致力于探讨能替代HCMV全病毒抗原的基因工程抗原，以完善IgM特异性血清学试验。本文通过构建HCMV DNA结合蛋白的一段基因的原核表达克隆，从而对表达产物的抗原性进行初步分析。 通过Oligosis软件设计UL57基因(aa540～604)两端引物，并在引物的5′端分别引入BamHⅠ和EcoRⅠ内切酶识别序列及保护位点。引物序列如下：P1：CTGGGATCCCCCAAAGGTGACGAC P2：GTGAATTCTCAGCGATTGAGGA。从感染的人胚肺成纤维细胞中提取和纯化HCMVAD169基因组，以纯化的核酸为模板，加入PCR反应体系进行UL57基因的扩增。
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黑龙江省4例HIV-1感染者病毒包膜变异特征分析
目的 调查HIV-1从供体到受体中病毒包膜序列变异情况,预测结构及其抗原性的变异趋势,为进一步的表型特征和抗HIV免疫研究奠定基础.方法 从4例HIV-1感染者外周血单个核细胞中提取DNA,设计跨病毒包膜的保守引物,进行PCR扩增,将扩增产物克隆至表达质粒载体,筛选阳性克隆进行序列测定.采用生物信息学方法对其进行编码氨基酸的变异性、系统发育以及包膜抗原特征进行分析和预测.结果 共获得4个病人的8个有完整开放读码框的包膜表达载体.在8个克隆中,包膜糖蛋白gp120内变异程度大的区域分别为信号肽区、可变区V1/V2区、恒定区C2区内近V3区部分、V4和V5区.变异包括点突变、氨基酸插入或缺失等.系统树分析发现所获得病毒克隆为B'型并与云南分离株LTG0218距离近.抗原性分析结果表明,除CD4结合区相对保守外,4株病毒在多处抗原表位中呈现较大变异性.结论 构建并鉴定了4例HIV-1 B'亚型感染者的8个包膜克隆的包膜表达载体.表型预测其均为R5亲嗜性毒株.生物信息学技术分析预测结果表明从供者到受者发生了包膜蛋白变异.
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不同抗原性甲3 (H3N2) 亚型流感病毒的鉴定及分子生物学研究
目的对不能用当年标准血清进行鉴定的甲3 (H3N2)亚型流感病毒进行抗原性分析及分子生物学研究. 方法用交互血凝抑制试验对毒株进行抗原性分析,提取病毒RNA,用一步法逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)扩增HA1(血凝素重链区)基因片段,产物纯化后测序并分析结果. 结果发现两株从鸡胚分离到的甲3(H3N2)亚型“D”相毒株与2株从MDCK细胞分离到的“O”相毒株抗原性已明显不同;其中1999年分离的“D”相与“O”相2毒株的抗原比大于256,氨基酸序列同源性为93%,抗原决定簇A区和B区氨基酸位点相差分别为50%及35%;受体结合部位(RBS)有6个氨基酸位点发生变异(左侧壁1个、前壁3个、右壁2个). 结论人群中存在没有发生“O”相变异的甲3(H3N2)亚型“D”相毒株,其抗原性与当前流行的“O”相变异株已明显不同,提示今后在鉴定甲3(H3N2)亚型毒株时,需根据毒株的来源和相特性选择适合的标准血清进行鉴定.
关键词： 甲3(H3N2)亚型流感病毒 抗原性 血凝素重链基因 氨基酸序列 -
SARS-CoV核衣壳蛋白抗原性鉴定和基因免疫研究
目的了解SARS冠状病毒(SARS-CoV)核衣壳蛋白(N蛋白)的抗原性及其基因疫苗的免疫原性.方法用大肠杆菌表达SARS-CoV的N蛋白,用SARS患者恢复期血清对其进行抗原性鉴定.再构建N蛋白基因疫苗,肌肉注射接种小鼠,检测小鼠血清中的抗N蛋白IgG抗体、脾细胞增殖和迟发型超敏反应.结果大肠杆菌重组表达的SARS-CoV N蛋白具有强抗原性,其基因疫苗能在小鼠有效诱导N蛋白特异性抗体和CD4+、CD8+ T淋巴细胞免疫应答.结论 SARS-CoV的N蛋白可作为重要的SARS血清学诊断抗原,并对于SARS的特异性预防和治疗有潜在的应用价值.
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轮状病毒北京地方株VP4基因的序列分析和原核系统的初步表达
A组轮状病毒是引起婴幼儿重症腹泻的主要病原[1],结构蛋白VP4是A组轮状病毒感染后刺激机体产生保护性抗体的主要抗原之一.由于VP4仅占病毒毒粒蛋白的1.5%,对VP4的高效表达将非常有助于进行其多肽的功能性、抗原性和免疫原性的研究.我们先前的工作发现A组轮状病毒在我国的流行以P1A型为主,本文初步探讨了轮状病毒P1A型我国地方株VP4基因的一级结构特点及通过序列分析预测血清型的分子基础,并且将地方株VP4完整基因在原核系统中进行了表达.
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SARS冠状病毒S蛋白表位合成肽抗原性的研究
目的研究SARS病毒合成肽疫苗.方法根据目前已知SARS病毒的基因组序列及其编码的蛋白质,选择了SARS病毒编码的spike蛋白抗原表位蛋白质序列,运用计算机抗原表位预测技术,筛选抗原表位,以合成肽抗原表位.通过对SARS病人血清进行筛选确定与血清高交叉反应的3个短肽,再合成多重抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP),与KLH偶联后免疫小鼠.结果筛选的3条与SARS病人血清反应强的肽,免疫小鼠均产生了高效价的抗体.结论以合成肽为免疫原研究SARS病毒肽疫苗有着广阔前景.
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1型与4型戊型肝炎病毒ORF2抗原性比较
目的比较1型和4型HEV ORF2抗原性的差异.方法对1型和4型ORF2同样位置各3个抗原片段分别进行表达,1型ORF2的3个重叠抗原以从N端到C端的顺序编号为1-pET-1、1-pET-2和1-pET-3;同样4型3个片段的编号为4-pET-1、4-pET-2和4-pET-3.用纯化后的各抗原片段分别建立酶联免疫检测方法检测临床肝炎病人血清136份,对检测结果进行统计分析.结果对6个抗原片段成功地进行了表达,纯化后6个抗原片段的纯度在95%以上.通过检测136份临床肝炎病人血清,显示1型抗原中3个抗原片段均存在抗原性差异,4型病毒ORF2中间的抗原片段与C端和N端抗原片段存在抗原性差异,1型和4型病毒之间N端抗原存在抗原性差异,具有统计学意义.结论1型和4型HEV ORF2 N端重组蛋白之间存在抗原性差异.
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卡波济肉瘤相关疱疹病毒包膜糖蛋白gpK8.1的抗原性与免疫原性分析
目的 表达并纯化卡波济肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)包膜糖蛋白gpK8.1,分析其抗原性和免疫原性.方法 异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropyl-β-D-ogalactopyranoside,IPTG)诱导重组大肠杆菌表达KSHV gpK8.1,用KSHV病人阳性血清作为抗体,经ELISA和Western blot检测其抗原性;用纯化的gpK8.1蛋白免疫新西兰兔,观察诱发抗体产生的时间及其效价,并用Western blot检测兔抗gpK8.1多克隆抗体特异性识别重组与天然gpK8.1抗原的能力,评价其免疫原性.结果 ELISA和Western blot证实3份KSHV阳性血清均能识别重组gpK8.1蛋白;重组gpK8.1蛋白免疫动物6周后,兔血清多克隆抗体效价达到105.结论 高效表达并纯化的gpK8.1蛋白具有良好的抗原性和免疫原性,为KSHV检测试剂和疫苗研究提供了基础资料.
关键词： 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 包膜糖蛋白gpK8.1 抗原性 免疫原性 -
人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)糖蛋白gp120部分糖基化位点突变对其抗原性影响
目的 研究HIV-1包膜糖蛋白gp120特定糖基化位点突变后对gp120抗原性的影响,并推测糖基化位点突变对结构的影响.方法 采用连接PCR方法,将获得的野生型gp120中选定N糖基化位点的Asn定点突变为Cln,使该位点去糖基化,构建DNA疫苗,免疫小鼠,ELISA检测鼠血清中的抗体,进行统计学分析,推测糖基化位点突变对gp120抗原性和结构的影响.结果 2组糖基化位点突变的gp120诱发非V3特异性抗体的能力较之野生型gp120有明显提高,但诱发V3特异性抗体能力没有显著提高,7个位点突变的gp120诱发V3特异性抗体能力有很大降低.结论 gp120部分糖基化位点的突变在一定程度上能提高或改变gp120的抗原性,这可能由突变导致的构象变化和/或糖基化寡糖链移除使原来被遮盖的抗原表位暴露引起.
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我国登革2型病毒43株包膜E蛋白MBP-B165抗原性的研究
目的通过对我国登革2型病毒株包膜E蛋白包括B区在内的第267～432氨基酸编码基因片段的表达，研究MBP-B165蛋白的抗原性。方法首先采用PCR方法扩增了编码B165蛋白的基因片段，并将其插入到pMal-C2 原核载体进行融合表达。采用蛋白印迹和ELISA法对表达产物进行特异性鉴定。用表达的融合蛋白MBP-B165免疫大白兔，并通过ELISA法检测兔免疫血清中登革2型病毒特异的抗体。结果表达的融合蛋白MBP-B165可与我国登革2型病毒株抗体特异结合，而且与登革1、3和4型病毒参考株的多克隆抗体均具有较高的反应性。用表达蛋白免疫大白兔可产生针对我国登革2型病毒株E蛋白的特异抗体，并且该抗体与其他3个型病毒参考株有交叉反应。结论我国登革2型病毒43株E蛋白包括B区在内的第267～432氨基酸序列具有一定的抗原性，而且具有黄病毒亚组特异的反应性表位，即4个型登革病毒的结构保守性表位。
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北京地区不同基因型Noro病毒的主要衣壳蛋白在大肠杆菌中的表达
目的 对北京地区的不同基因型Noro病毒的主要衣壳蛋白(VP1)进行表达,得到Noro病毒抗原,为对Noro病毒做进一步的深入研究打下基础.方法 用PCR分别从先前研究得到的含北京Noro病毒主要衣壳蛋白VP1编码基因的重组质粒pBST-CR2987(G Ⅱ-3)及pBST-CR2932(G Ⅱ-4)中扩增得到VP1全基因,然后将目的基因亚克隆到表达载体pET-30a(+)中,得到重组质粒,转化BL21(DE3)感受态细胞,利用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导蛋白表达.通过SDS-PAGE和Western blot检测蛋白的表达和抗原性,并对表达产物进行了纯化.结果 (1)双酶切和测序证明得到了VP1的重组表达载体.CR2987 VP1基因全长1647 bp,含编码549个氨基酸的单一的开放读码框架(ORF);CR2932 VP1基因全长1623 bp,含编码541个氨基酸的单一的ORF.(2)重组表达的VP1主要以包涵体的形式存在,在诱导后4～6 h表达量高.(3)重组表达的VP1能够被豚鼠抗Noro病毒VP1的特异性免疫血清及鼠抗His标签的抗体所识别.(4)纯化后的蛋白能够为人血清所识别.结论 GⅡ-3型及GⅡ-4型Noro病毒北京地方株的VP1在原核体系中获得表达,表达的VP1可以被特异性免疫血清及人血清所识别,说明其具有抗原活性.
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G145R变异乙型肝炎表面抗原诱导的抗体性质研究
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)变异可导致抗原性改变.HBsAg a决定簇常见的变异位点是G145R.G145R变异可能改变原来的抗原表位,并形成新的抗原表位.本研究探讨G145R HBsAg能否刺激机体产生抗体及免疫应答的情况.
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SARS-CoV、HCoV-229E和OC43核衣壳蛋白的克隆表达及抗原相关性分析
目的克隆表达SARS冠状病毒(SARS-CoV)和人冠状病毒(HCoV-229E、HCoV-OC43)核衣壳(N)蛋白,并对其重组蛋白的抗原相关性进行探讨.方法RT-PCR扩增SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的N基因全长序列,克隆到原核表达载体pQE30,IPTG诱导表达重组蛋白,用Western blot和免疫荧光鉴定.结果获得SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43 His-N融合蛋白的相对分子质量(Mr)分别约为47×103、44×103、50×103,与相应预测值相符,Western blot和免疫荧光证实,3种融合蛋白仅与相应的免疫血清特异性结合,3种蛋白的抗原性相互间无交叉反应.结论获得具有免疫原性的SARS-CoV、HCoV-229E和HCoV-OC43的核衣壳融合蛋白,其3种N蛋白抗原性在免疫动物血清中不存在交叉反应.
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A、C群脑膜炎奈瑟球菌免疫原性及毒性和传代稳定性研究
目的 为保证疫苗质量的一致性和可控性,对A、C群脑膜炎奈瑟球菌结合疫苗生产用菌株CMCC(B)29201和CMCC(B)29205株进行毒性和抗原传代稳定性研究,并对30代次菌进行脑腔毒性、免疫原性和产糖质量分析.方法 将A、C群脑膜炎奈瑟球菌工作种子批菌种分别连续传代至30代次并收获3、5、10、15、20、25及30代次菌液,小鼠腹腔注射观察各代次毒性,试管凝集试验和间接ELISA测定各代次抗原性.其中30代次菌液进行小鼠脑腔攻击观察是否引起脑组织病理改变,小鼠皮下免疫观察免疫原性,同时进行发酵培养提取荚膜多糖的质量分析.结果CMCC(B)29201株和CMCC(B)29205株工作种子批菌种的半数致死量(LD50)均≥109个/ml,30代次内的LD50也均≥109个/ml,30代次菌液脑腔毒性测定显示均无病理改变;抗原性试管凝集效价均达1∶320,30代次内的试管凝集效价均达1∶320,ELISA几何平均滴度(GMT)分别为1∶4835和1∶3915,且30代次内的ELISA效价分别为1∶4315和1∶3752以上;30代次菌液的血清杀菌抗体均≥1∶32,用第30代次工作种子批菌种生产的A群和C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖各项检定指标均达到国家标准.结论 A、C群脑膜炎奈瑟球菌结合疫苗生产用菌株CMCC(B)29201和CMCC(B)29205株毒性低、抗原性和免疫原性良好,连续传代至30代次仍保持较低的毒性和较好的抗原性及免疫原性,纯化的A群和C群脑膜炎奈瑟球菌荚膜多糖质量符合质控要求.
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钩端螺旋体外膜蛋白GroEL优势T-B联合抗原表位及其免疫原性鉴定
致病性钩端螺旋体（以下简称钩体）感染引起的钩体病是全球流行的人兽共患传染病［1-3］。现行钩体疫苗保护力微弱且有较大副作用［3-5］。多抗原肽（ multiple antigenic pep-tides，MAP）疫苗具有能同时提呈多种抗原表位、提呈作用强、形成共价表位提高抗原性等优点［6］。本研究中我们检测了groEL基因在我国流行的致病性钩体血清群中分布、筛选并确定了GroEL分子中优势T和B细胞（ T-B）联合抗原表位及其激活T细胞亚群的能力，以期为今后研制通用型钩体MAP疫苗提供候选抗原表位。
