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DNA甲基转移酶1在人瘢痕疙瘩成纤维细胞中的表达及意义
目的 探讨DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferase 1,DNMT1)在瘢痕疙瘩的不同生长期和不同部位的成纤维细胞表达及其意义.方法 收集53例瘢痕疙瘩患者手术切除的瘢痕疙瘩标本,并按生长期分为A(＜6个月)、B(6 ～12个月)、C(1～2年)、D(＞2年)4组；免疫组织化学法检测各组标本正常皮肤、浸润部、增生部及老化部成纤维细胞DNMT1的表达并比较差异；RT-PCR法检测各组标本及不同部位成纤维细胞DNMT1mRNA的表达.结果 DNMT1在成纤维细胞中主要分布于细胞核内；瘢痕疙瘩成纤维细胞DNMT1蛋白阳性表达率(72％)及DNMT1mRNA表达均高于正常皮肤成纤维细胞(8％,P =0.001)；瘢痕疙瘩生长期较短组成纤维细胞DNMT1阳性表达率(100％,评分:10.47±1.85)及DNMT1mRNA表达均高于生长期较长组(45％,评分:7.71 +1.80,P =0.007)；瘢痕疙瘩浸润部(100％,评分:10.47±1.85)成纤维细胞DNMT1阳性表达率及DNMT1mRNA表达均高于增生部(78％,评分:6.63±1.75)与老化部(38％,评分:5.53 +1.55,P=0.001).结论 DNMTI在瘢痕疙瘩发病中具有重要作用；随着瘢痕疙瘩生长期的延长,DNMT1的表达有降低趋势；随着瘢痕疙瘩中央成纤维细胞老化,DNMT1表达降低.提示DNMT1在瘢痕疙瘩生长过程中起着重要的作用,并且与瘢痕疙瘩浸润生长密切相关.
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慢病毒介导hIL-24基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、迁移及侵袭性的影响
目的 研究人白细胞介素-24(human interleukin-24,hlL-24)基因对体外培养的人瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KF)增殖、迁移、侵袭性的影响.方法 将携带hIL-24及绿色荧光蛋白的慢病毒载体(LV-hlL-24-GFP,KF-hIL-24组)及空载体(LV-GFP,KF-NC组)感染KF细胞,并设空白对照组(KF组),应用实时定量PCR和Western blot分别检测hlL-24 mRNA及蛋白的表达;MTT法检测KF细胞增殖情况;流式细胞仪法测定KF细胞周期;划痕实验和Trans-well小室实验检测KF细胞的体外迁移和侵袭能力.结果 hIL-24慢病毒载体感染KF细胞96 h后,KF-hIL-24组hIL-24 mRNA和蛋白的表达量明显高于KF-NC组和KF组,差异有统计学意义(P ＜0.01);MTT结果显示,KF-hIL-24组吸光度A值明显降低,与KF-NC组比较,差异有统计学意义(P＜0.05);细胞周期结果显示, hIL-24基因阻滞KF细胞在G1期[(75.40±2.10)％]、S期[(4.96±1.60)％]和G2期[(0.01 ±0.01)％]细胞比例下降,与KF-NC组比较,差异有统计学意义(P＜0.01);划痕实验和Trans-well实验结果显示,hIL-24慢病毒载体能够抑制KF细胞的体外迁移和侵袭能力.结论 hlL-24慢病毒载体能够抑制KF细胞增殖、细胞周期进程、迁移及侵袭能力.
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人瘢痕疙瘩成纤维细胞中CASK/Id1通路的初步研究
目的 验证人瘢痕疙瘩成纤维细胞中钙/钙调蛋白依耐性丝氨酸蛋白激酶(calcium/calmodulin dependent serine protein kinase,CASK)/分化抑制因子1(inhibitors of differentiation 1,Id1)通路的存在及意义.方法 通过免疫荧光激光共聚焦证实瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中CASK和Id1蛋白表达和定位;RT-PCR和Western-blot分析瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中CASK和Idl的表达和差异;通过免疫沉淀验证瘢痕疙瘩成纤维细胞中CASK和Idl蛋白的天然结合.结果 正常情况下体外培养的瘢痕疙瘩和正常皮肤成纤维细胞中均存在CASK和Id1蛋白的表达,CASK和Id1主要分布在成纤维细胞胞浆和胞核中;RT-PCR结果表明瘢痕疙瘩组CASKmRNA的表达量为0.658±0.024,低于正常对照组的I.076±0.008(t=11.159,P＜0.05);Id1的表达量为0.497±0.014,高于正常对照组的0.307±0.017(t=15.148,P＜0.05);Western-blot结果表明瘢痕疙瘩组CASK蛋白的表达量为0.057±0.006,低于正常对照组的0.168±0.012(t=13.524,P ＜0.05);Idl的表达量为0.812±0.035,高于正常对照组的0.368±0.031(t=16.356,P＜0.05);免疫沉淀结果显示,CASK沉淀物中能检测到Id1,Id1沉淀物中能检测到CASK,CASK和Id1在瘢痕疙瘩成纤维细胞中存在天然结合.结论 可能存在CASK/Id1信号通路参与了瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖,这与瘢痕疙瘩的发生存在一定联系.
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热休克蛋白47重组质粒对病理性瘢痕的体内干预研究
目的 利用RNAi技术通过热休克蛋白47重组质粒(HSP47siRNA)和脂质体的混合液对裸鼠病理性瘢痕动物模型的体内干预,分析HSP47基因在病理性瘢痕生成中的意义.方法 构建裸鼠病理性瘢痕动物模型,第16天腹腔麻醉后实验组裸鼠在病理性瘢痕内注射质粒、脂质体混和液0.25 ml,对照组裸鼠腹腔注射PBS液0.25 ml,原笼饲养,7 d回收标本,分别作mRNA水平、胶原蛋白水平以及免疫组化检测.结果 对照组与实验组总胶原含量分别为(91.71±1.24)%和(82.12±4.79)%;实时荧光PCR检测HSP47mRNA表达对照组和实验组分别为1 042 862.01±604 194.36和306 123.68±105 857.08;Ⅰ型胶原蛋白mRNA表达对照组和实验组分别为10 228 614.70±2 532 879.04和6 011 841.97±2 886 897.17;对照组和实验组体积分别为(255.60±21.34)mm~3和(132.99±24.06)mm~3,上述指标检测结果组间比较差异均有统计学意义(P<0.05);而这些变化在增生性瘢痕组并没有出现,增生性瘢痕组胶原的变化、体积的变化均无统计学意义.结论 采用RNAi技术,经过HSP47siRNA表达载体特异性沉默病理性瘢痕中HSP47基因表达后,瘢痕疙瘩中胶原蛋白的合成和分泌均能得到明显抑制,提示HSP47基因促进瘢痕疙瘩生成,并为抑制瘢痕疙瘩提供了新的靶点.
关键词： RNA干扰 HSP47热休克蛋白质类 瘢痕疙瘩 -
辛伐他汀对不同病理条件刺激的瘢痕疙瘩成纤维细胞功能的影响
目的 探讨辛伐他汀在不同病理因素刺激下对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及病变相关蛋白表达的影响.方法 采用组织块贴壁法培养瘢痕疙瘩成纤维细胞.CCK-8检测常氧和低氧条件下不同浓度辛伐他汀(0.01、0.1、1、10、50、100、500 μmol/L)作用瘢痕疙瘩成纤维细胞24、48 h后,对其增殖的影响.流式细胞技术检测常氧、低氧以及10 ng/ml TGF-β1作用下10 μmol/L辛伐他汀干预24、48 h对瘢痕疙瘩成纤维细胞凋亡的影响,并用Western Blot检测相同干预条件下细胞Ⅰ型胶原、结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和TIMP-1的合成情况.结果 ①在常氧和低氧条件下,辛伐他汀作用瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h或48 h,能明显抑制细胞增殖,随着药物浓度增加抑制作用逐渐增大,而且在低氧条件下对细胞增殖的抑制作用比常氧条件下更强.②10 μmol/L辛伐他汀作用24 h或48 h,并不能明显影响常氧和10 ng/ml TGF-β1作用下的瘢痕疙瘩成纤维细胞的凋亡,对低氧条件下的细胞则有显著的促进凋亡的作用(24 h和48 h凋亡率分别增加155.6％和478.8％,P＜0.05).③10 μmol/L辛伐他汀能显著减少低氧或10 ng/ml TGF-β1作用下的瘢痕疙瘩成纤维细胞Ⅰ型胶原和CTGF的合成(P＜0.05),对常氧条件的Ⅰ型胶原和CTGF的表达无明显影响.10 μmol/L辛伐他汀还能明显增强低氧条件下的TIMP-1的表达(P＜0.05),对常氧和TGF-β1作用下的TIMP-1的表达虽然也有促进作用,但作用并不显著.结论 辛伐他汀对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖、凋亡及纤维化相关蛋白表达的作用有剂量依赖性并受条件影响有所不同,在低氧条件下它对瘢痕疙瘩成纤维细胞的作用更强.
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瘢痕疙瘩成纤维细胞线粒体功能障碍及其对细胞代谢功能的影响
目的 比较瘢痕疙瘩成纤维细胞(KFb)与正常皮肤成纤维细胞(NFb)在常氧和低氧培养状态下的线粒体功能和能量代谢状态,以探讨瘢痕疙瘩成纤维细胞线粒体功能在瘢痕疙瘩发病中的作用.方法 采用组织块贴壁法原代培养KFb和NFb.常氧和低氧(2％O2)条件下培养KFb与NFb,CCK-8检测细胞增殖情况,分光光度法测定细胞氧消耗率和乳酸生成,化学发光仪检测细胞ATP生成情况,流式细胞仪检测细胞线粒体数量和活性氧含量,透射电镜观察细胞线粒体超微结构,RT-PCR检测线粒体融合/分裂相关基因MFN1、MFN2、FIS1的表达.结果 常氧培养1～5d,KFb与NFb的细胞数之比分别为0.98、1.04、1.18、1.08和1.31,2％O2条件下培养1～5d,KFb与NFb细胞数之比分别为1.15、1.13、1.13、1.30和1.31.常氧下KFb的细胞耗氧率和ATP含量分别比NFb低12.95％和45.70％ (P ＜0.05),低氧培养48 h后KFb耗氧率和ATP含量分别增加25.92％和56.24％ (P ＜0.05),而NFb耗氧率和ATP变化不明显.常氧条件下KFb乳酸生成较NFb少,2％低氧条件下培养1～5d的KFb乳酸生成量较常氧下的KFb分别增高19.87％、34.51％、92.64％、75.31％、125.38％,低氧培养1～5d的NFb乳酸生成与常氧下相比并无明显变化.常氧条件下KFb与NFb中活性氧含量相差不大;2％低氧条件下KFb和NFb中活性氧均随时间逐渐增加,NFb在低氧6h后活性氧升高到稳定水平(6h、12h、24 h分别增加86.30％、79.04、94.83％),KFb在低氧6h后活性氧仍持续升高(6h、12h、24 h分别增加42.68％ 、115.25％、209.11％).KFb中线粒体数量比NFb多15.33％(P＜0.05),电镜下观察发现KFb线粒体明显增大,嵴融合消失,RT-PCR检测发现KFb中MFN1、MFN2、FIS1表达比NFb分别升高33.27％、113.39％和20.34％(P＜0.05).结论 KFb可能存在线粒体功能障碍,引起细胞代谢模式改变,使得KFb能适应低氧下细胞的持续增殖.
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基于重测序技术对瘢痕疙瘩形成相关基因结构变异的初步探讨
目的 利用全基因重测序技术初步探讨与瘢痕疙瘩形成相关基因的结构变异.方法 选取1个典型瘢痕疙瘩家系,共4代27例,利用全基因组重测序技术,对该家系中5例(4例瘢痕疙瘩患者,1例正常人)基因组DNA进行数据分析,并对所获信息进行数据库比对和变异注释.结果 通过生物信息学分析、数据库比对及变异注释后,发现了2个与瘢痕疙瘩相关的结构变异.利用靶基因功能分析软件DAVID对筛选出来的结构变异进行注释和信号通路分析,发现人四旋蛋白8(TSPAN8)在所有检测的瘢痕疙瘩患者中,均有一段168 bp的倒置,其包含了TSPAN8基因的第4个外显子.结论 TSPAN8表达的肿瘤细胞,可通过上调血管内皮生长因子及其受体的表达,促进相邻的成纤维细胞分泌基质金属蛋白酶及尿激酶.此家系中该基因4号外显子的倒置,可能会导致该蛋白在信号转导过程的调节紊乱,从而导致瘢痕疙瘩的形成.
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同位素标记相对和绝对定量技术在家族性瘢痕疙瘩蛋白质组学研究中的应用
目的 通过比较家族聚集性瘢痕疙瘩(FK)和散发性瘢痕疙瘩(SK)、增生性瘢痕(HS)、正常皮肤(NS)组织样本间蛋白质组表达的差异,筛选出与FK关系密切的蛋白,以期找到其特异性标志物,探索相关发病机制.方法 应用同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative and absolute quantitation,iTRAQ)技术,对FK、SK、HS、NS 4组,每组6例样本,分别进行酶解、标记及串联质谱分析,进行分子生物学验证及生物信息学分析.并随机挑选2种差异蛋白以蛋白质印迹法进行验证.采用SPSS 16.O软件,用独立样本t检验对4组蛋白检测结果进行统计学分析,P＜0.05为差异有统计学意义,筛选出变化倍数在1.2倍以上的差异蛋白.结果 测定到蛋白质共2 450种,其中各组间差异蛋白数量及情况:与NS相比,FK特异性表达上调的蛋白共250种,下调的蛋白有281种;SK中特异性表达上调的蛋白共281种,下调的蛋白有232种;HS中特异性表达上调的蛋白共199种,下调的蛋白有233种.与SK相比,FK特异性表达上调的蛋白共64种,下调的蛋白有164种;HS特异性表达上调的蛋白共79种,下调的蛋白有169种;与HS相比,FK特异性表达上调的蛋白共124种,下调的蛋白有115种.这些差异蛋白在细胞外基质、细胞黏附及生物代谢等多条重要信号转导通路中集中分布.蛋白印迹法验证结果表明2种差异蛋白(P3H1和RCN-3)变化趋势与iTRAQ技术检测结果相同.结论 iTRAQ技术能较好地显示瘢痕疙瘩、增生性瘢痕与正常皮肤组织间的蛋白质表达差异,将有助于揭示其发病机制,找到其特异性标志物用于诊断和治疗.
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蛋白糖基化抑制剂对病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白的表达与功能的影响
目的 研究N-糖链合成抑制剂衣霉素对病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白的表达与诱导凋亡功能的影响.方法 瘢痕疙瘩及增生性瘢痕各5例,以健康皮肤为对照,免疫组织化学法检测组织中成纤维细胞Fas蛋白表达;组织块贴壁法培养成纤维细胞;Western Blot法及流式细胞术检测衣霉素处理及未处理各组成纤维细胞Fas蛋白水平的表达及凋亡率的变化.结果 病理性瘢痕及健康皮肤成纤维细胞胞质及胞膜中均可见Fas蛋白表达;增生性瘢痕、瘢痕疙瘩及健康皮肤成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平依次降低,3组成纤维细胞在Fas单克隆抗体(Fas monoelonal antibody,FasMcAb)作用后凋亡率与Fas蛋白糖基化成正相关,衣霉素可明显降低病理性瘢痕成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平,但对健康皮肤成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平抑制作用不明显.结论 FasMcAb诱导病理性瘢痕成纤维细胞凋亡与成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平成正相关,而衣霉素可显著降低成纤维细胞Fas蛋白糖基化水平.
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TGF-β1诱导瘢痕疙瘩表皮细胞发生上皮-间质转化的研究
目的 通过在体外应用TGF-β1诱导瘢痕疙瘩表皮细胞,探讨其是否发生上皮-间质转化,以及上皮-间质转化对表皮细胞中干细胞表面标志的影响.方法 采集耳部瘢痕疙瘩标本培养表皮细胞,以培养基中终浓度为1 ng/ml的TGF-β1诱导瘢痕疙瘩表皮细胞5d作为实验组,以未诱导的瘢痕疙瘩表皮细胞作为阴性对照组,每组样本均为3例.分别采用免疫荧光染色、Real-time PCR和Western blot检测上皮-问质转化相关标志和基因的表达,并采用Real-time PCR检测表皮干细胞表面标志的表达.采用独立样本t检验对检测结果进行统计学分析.结果 上皮-间质转化相关基因Snail2的mRNA表达从诱导前的0.91±0 23上升至诱导后的1.69 ±0.10,间质细胞标志波形蛋白由诱导前5.86±2.07明显增加至诱导后的24.29 ±5.39(P ＜0.05),而上皮标志E-钙粘蛋白的mRNA表达由诱导前的1.06 ±0.19下降为诱导后的0.65 ±0.09,表达减弱;于细胞表面标志CD29和Lgr6的mRNA表达分别由诱导前0.55±0.14和1.61±0.31增加至诱导后1.19 ±0.12和3.84±0.62,均明显升高(P＜0.05).免疫荧光染色和Western blot均证实细胞E-钙粘蛋白减少,波形蛋白增加,同时p-Smad3表达增加.结论 TGF-β1通过诱导Snail2基因上调启动瘢痕疙瘩表皮细胞发生上皮-间质转化,此过程有TGF-β1/Smad3信号通路参与,而瘢痕疙瘩表皮细胞中干细胞的表面标志发生改变.
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独角莲根茎水提取物对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用
目的 探讨独角莲根茎水提取物(AEoTGE)对瘢痕疙瘩成纤维细胞的抑制作用,测定其半数抑制浓度及凋亡率.方法 采用组织块法体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,以透射电镜鉴定细胞超微结构.四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)检测不同浓度AEoTGE(3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000g/L)作用瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h后的抑制率,计算其半数抑制浓度(IC50).采用5-乙炔基-2-脱氧尿苷(EdU)染色法测定瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖情况,流式细胞技术检测其凋亡率.结果 ①应用不同浓度(3.125～100.000 g/L) AEoTGE作用瘢痕疙瘩成纤维细胞24 h后,随AEoTGE浓度增加对细胞抑制作用增强,与对照组比较,细胞抑制率差异有统计学意义(P＜0.05)；②瘢痕疙瘩成纤维细胞经AEoTGE作用后的半数抑制浓度(IC50)为(35±0.27) g/L；③EdU染色示35 g/L AEoTGE组与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；④FITC-Annexin V/PI示AEoTGE组凋亡率为(72.07±0.70)％,对照组为(23.48±1.63)％(P＜0.05).结论 体外培养人瘢痕疙瘩成纤维细胞经AEoTGE作用24 h后,半数抑制浓度(IC50)为(35±0.27) g/L,并可明显诱导细胞凋亡,凋亡率为(72.07±0.70)％.
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肥大细胞类胰蛋白酶在病理性瘢痕中的表达研究
目的 研究肥大细胞类胰蛋白酶(mast cell tryptase,MCT)在病理性瘢痕中的表达及分布情况,探讨MCT基因在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤中是否存在差别.方法 采集未经治疗的瘢痕疙瘩、增生性瘢痕及正常皮肤各20例,应用免疫荧光组化对MCT的表达进行定位,应用实时荧光相对定量PCR进行mRNA基因水平的相对定量分析.结果 MCT主要集中在瘢痕组织的胶原纤维柬之间,以瘢痕组织浅层分布较多;实时荧光PCR相对定量结果显示MCT基因在瘢痕疙瘩中表达高于增生性瘢痕和皮肤(P<0.01),瘢痕疙瘩中MCT基因表达量约为增生性瘢痕的2.5倍,皮肤的5.4倍.结论 MCT在瘢痕的形成中可能起一定的作用.
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干扰人整合素蛋白β5基因表达对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力的影响
目的 观察干扰人整合素蛋白β5基因对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖能力的影响,探讨其在瘢痕疙瘩发病中的作用.方法 构建干扰整合素蛋白β5慢病毒载体并感染瘢痕疙瘩成纤维细胞,通过PCR及Western Blot方法观察感染后细胞整合素蛋白β5基因和蛋白的表达情况;MTT法检测不同时间点细胞的增殖情况.结果 慢病毒感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后,空白对照组、空载病毒组及慢病毒干扰组中整合素蛋白β5 mRNA及蛋白的表达量分别为1.00±0.00、1.08±0.05、0.34±0.01和0.91±0.03、0.93±0.02、0.28 ±0.07,与空载病毒组及空白对照组比较,慢病毒干扰组中整合素蛋白β5 mRNA及蛋白的表达量均明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01);慢病毒感染瘢痕疙瘩成纤维细胞后,各组间细胞的增殖情况在接种24 h后无显著差异,48 h后慢病毒干扰组的增殖较其他2组明显变慢(P＜0.01).结论 整合素蛋白β5基因可促进瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖.
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缺氧状态下瘢痕疙瘩成纤维细胞条件培养基对血管形成能力的影响
目的 通过观察缺氧状态对瘢痕疙瘩成纤维细胞条件培养基诱导血管形成能力的影响,探讨缺氧微环境在瘢痕疙瘩浸润性生长中的作用.方法 采用组织块法体外培养瘢痕疙瘩成纤维细胞,将其置入缺氧培养箱(2％O2)进行培养,并以常氧培养箱(20％ O2)培养作为对照,48 h后收集上清,并与内皮细胞培养基按1∶1混合后作为条件培养基.按常规方法培养人脐静脉血管内皮细胞.采用real time PCR和ELISA法,检测缺氧刺激对瘢痕疙瘩成纤维细胞促血管生成因子如血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血管生成素-1(angiopoietin-1,Ang-1)和periostin表达和分泌的影响;条件培养基孵育血管内皮细胞,采用CCK-8法测定其增殖情况,Transwell小室法检测其迁移和侵袭能力,基质胶小管形成实验观察其小管形成能力.结果 缺氧刺激使瘢痕疙瘩成纤维细胞VEGF、Ang-1和periostin因子在mRNA水平分别增加了75％、43％、118％(P＜0.05),在分泌蛋白水平分别增加了30.2％、14.2％、19.5％ (P ＜0.05);缺氧状态下在瘢痕疙瘩成纤维细胞条件培养基孵育血管内皮细胞增殖的吸光度值,在1、2和3d分别为0.67±0.07、0.84±0.09和1.08±0.10,均高于其对照组(0.52 ±0.08、0.72±0.10和0.91±0.14,P＜0.05);缺氧状态下瘢痕疙瘩成纤维细胞条件培养基诱导血管内皮细胞的迁移、侵袭和小管形成数目分别为(73.2±8.9)、(56.3±12.5)、(9.66±1.96)个/高倍视野,均高于其对照组[(59.0±8.0)、(35.5±8.5)、(6.5±1.87)个/高倍视野,P＜0.05].结论 缺氧刺激增加瘢痕疙瘩成纤维细胞的促血管形成因子的合成分泌,其条件培养基显著增加血管内皮细胞的血管形成能力,提示缺氧微环境可能通过促新生血管形成在瘢痕疙瘩浸润性生长中起着重要作用.
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eIF4E、p-eIF4E和Mcl-1在病理性瘢痕组织中的表达和意义
目的 研究真核细胞翻译起始因子( eIF4E)、磷酸化真核细胞翻译起始因子(p-eIF4E)和髓样细胞白血病-1(myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)在病理性瘢痕中的表达情况及其相互关系,探讨它们在瘢痕形成中的作用及机制.方法 利用实时荧光定量PCR法检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中eIF4E和Mel-1的mRNA表达量.利用蛋白质免疫印迹( Western blotting)法检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中eIF4E、p-eIF4E和Mcl-1的蛋白表达情况.结果 正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中eIF4E的mRNA及蛋白质的相对表达水平分别为1.380±0.450、1.230±0.230、5.400±0.450、5.460±0.460和0.597±0.060、0.590±0.040、0.694±0.066、0.697±0.022.正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中p-eIF4E的蛋白质表达量为0.202±0.037、0.216±0.019、0.426±0.026、0.433±0.027.Mcl-1的mRNA及蛋白质的相对表达水平分别为1.510±0.660、1.400±0.530、6.650±0.850、7.230±1.530和0.589±0.059、0.660±0.063、0.870±0.118、0.914±0.064.病理性瘢痕组织中eIF4E的mRNA及蛋白质表达显著高于正常皮肤、成熟瘢痕(P＜0.05)；病理性瘢痕组织中Mcl-1的mRNA及蛋白质表达增高,与正常皮肤、成熟癜痕对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)；病理性瘢痕组织中eIF4E的磷酸化程度高于正常皮肤和成熟瘢痕(P＜0.05).病理性瘢痕组织中eIF4E的mRNA及蛋白质表达与Mcl-1的mRNA及蛋白质表达呈正相关.结论 eIF4E在病理性瘢痕组织中表达增高,磷酸化程度增高,p-eIF4E可能通过调节Mcl-1等细胞周期调控因子而促进癜痕组织中细胞的增生,对病理性瘢痕的形成可能起着重要作用.
关键词： 真核细胞翻译起始因子 髓样细胞白血病-1 增生性瘢痕 瘢痕疙瘩 -
瘢痕疙瘩microRNA表达谱的筛选及miR-199a-5p生物功能的初步研究
目的 探讨并筛选出瘢痕疙瘩相关微小RNAs(miRNAs),检测其对瘢痕疙瘩成纤维细胞(keloid fibroblasts,KF)增殖的影响.方法 收集手术切除瘢痕疙瘩及正常皮肤组织标本各8例,采用基因芯片检测瘢痕疙瘩与正常皮肤组织差异表达的miRNA,并采用qRT-PCR验证,在瘢痕疙瘩成纤维细胞株中转染miRNA模拟物,模拟细胞中成熟miRNA的高表达,用EdU检测方法检测其对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的影响.结果 ①通过芯片检测发现包括miR-199a-5p在内的17个差异表达的miRNAs.②qRT-PCR验证结果显示miR-199a-5p表达下调,与芯片检测结果相一致.③miR-199a-5p模拟物转染组与阴性对照组EdU的阳性率分别为(20.72±2.50)％和(27.68±4.92)％,miR-199a-5p模拟物转染组瘢痕疙瘩成纤维细胞的增殖率下降(t=2.183,P=0.047).同时,细胞的生长周期分布也发生改变,MiR-199a-5p模拟物转染组S期与G2/M期细胞百分比分别为(33.93±1.30)％和(10.87±0.80)％,阴性对照组分别为(31.39±0.79)％和(9.27±0.46)％,差异有统计学意义(P＜0.05).结论 ①瘢痕疙瘩中miRNA的差异表达有组织特异性;②miR-199a-5p在瘢痕疙瘩中的显著低表达,可影响瘢痕疙瘩成纤维细胞周期分布,抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖,提示miR-199a-5p可能参与了瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的调控.
关键词： 瘢痕疙瘩 基因表达谱 微小RNA-199a-5p 成纤维细胞 -
P57kip2和Maspin在病理性瘢痕组织中的表达
目的 研究P57kip2和Maspin在病理性瘢痕组织中的表达情况及相互关系,探讨它们在病理性瘢痕形成中的作用及机制.方法 应用免疫组化SP法结合计算机病理图像分析和逆转录聚合酶链反应( RT-PCR)检测正常皮肤、成熟瘢痕、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩组织中P57kip2和Maspin的表达并对其表达进行统计学分析.结果 病理性瘢痕组织中P57kip2蛋白的表达定位于成纤维细胞的细胞核内,且P57kip2蛋白及mRNA的表达减少,与正常皮肤、成熟瘢痕对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).病理性瘢痕组织中Maspin蛋白的表达定位于成纤维细胞的细胞质和细胞核内,且Maspin蛋白及mRNA的表达减少,与正常皮肤、成熟瘢痕对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05).P57kip2与Maspin蛋白表达存在明显正相关(P＜0.O1).结论P57kip2与Maspin在病理性瘢痕组织中均表达减少,是病理性瘢痕相关基因,两者存在明显正相关,是病理性瘢痕的形成机制之一.P57kip2和Maspin可能通过成纤维细胞在病理性瘢痕的形成过程中发挥着重要作用.
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圆盘状受体在病理性瘢痕成纤维细胞中表达
目的 探讨圆盘状受体(discoidin domain receptors,DDRs)在病理性瘢痕形成中的作用.方法 取13例瘢痕疙瘩,10例增生性瘢痕,10例正常皮肤,体外培养成纤维细胞,经荧光定量PCR,定量检测成纤维细胞中DDR1、DDR2水平.结果 瘢痕疙瘩、增生性瘢痕成纤维细胞中DDR1水平明显高于正常皮肤成纤维细胞(20.98对4.2,P＜0.01;7.9对4.23,P＜0.05),瘢痕疙瘩与增生性瘢痕成纤维细胞中DDR1相比,有统计学意义(20.98对7.9,P＜0.01),DDR2在瘢痕疙瘩、增生性瘢痕成纤维细胞和正常皮肤成纤维细胞中差异无统计学意义(358,332对278,P＞0.05).结论 荧光定量PCR可准确测定组织中DDR含量,病理性瘢痕成纤维细胞的细胞学行为与DDR有关.
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瘢痕疙瘩发病风险与p53基因第72位密码子多态性的关系
目的研究p53基因第72位密码子多态性与瘢痕疙瘩发病风险的关系.方法采用聚合酶链反应-反向点杂交、DNA直接测序方法检测了45例瘢痕疙瘩患者与60名正常对照的p53基因第72位密码子多态性位点的基因型.结果瘢痕疙瘩患者的Pro等位基因频率明显高于正常对照组(x2=4.485,P=0.034).瘢痕疙瘩患者的Pro/Arg、Arg/Arg基因型频率与正常对照组相比差异无统计学意义(x2值分别为0.949和1.346;P值分别为0.330和0.246),而瘢痕疙瘩患者的Pro/Pro基因型频率明显高于对照组(x2=4.375,P=0.036).提示Pro/Pro基因型者患瘢痕疙瘩的风险性明显高于Pro/Arg、Arg/Arg基因型者(OR=2.400,95%CI:1.048～5.498).结论p53基因第72位密码子多态性位点的基因型检测可能对判断瘢痕疙瘩高危个体具有指导意义.
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血管生成因子及其受体过表达与瘢痕疙瘩侵袭性生长
目的探讨瘢痕疙瘩组织中血管生成因子及其受体表达异常与侵袭性生长的关系.方法将17例患者的瘢痕疙瘩(Ke)标本分成老化部组(Ke-A,n＝9)、增生部组(Ke-P,n＝13)、浸润部组(Ke-I,n＝9)、Ke周围正常皮肤组(Ke-N,n＝10)和非Ke患者正常皮肤组(NS,n＝10),采用组织学、免疫组化染色和计算机图像分析方法,检测碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)及其受体-Flg,血管内皮生长因子(VEGF)及VEGF/KDR复合物(11B5),血小板源性生长因子(PDGF-A)和受体-PDGFR-α以及α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达水平.结果组织中的成纤维细胞(Fb)、单核-巨噬细胞,血管内皮细胞和周细胞、表皮细胞和附属器上皮细胞对bFGF、Flg、VEGF、llB5、PDGF-A和PDGFR-α均有表达.5组标本强弱依次为:Ke-I＞Ke-N≌Ke-P＞Ke-A≌NS(P＜0.05～0.01),Flg＞bFGF≌PDGFR-α＞PDGF-A＞≌llB5＞VEGF(P＜0.01),仅在Ke-I组α-SMA阳性的肌成纤维细胞强表达llB5和VEGF.组织学微血管呈现内膜过度增生和血管闭塞,伴有浅层血管过度扩张和出血征象.结论:瘢痕疙瘩侵袭生长可能与血管生成因子及其受体过表达有关,肌成纤维细胞异常表达11B5可能是其具有肿瘤生长特性的重要因素,阻断其生物学作用可能对开展临床治疗有积极意义.
