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新型肝穿刺建立原发性肝多房棘球蚴病小鼠模型
目的 探讨新型肝穿刺方法建立原发性肝多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,E.m)小鼠模型.方法 将120只12w龄健康雌性小鼠随机分为切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺接种、开腹肝穿刺接种和经皮肝穿刺接种3组,每组40只.20%乌拉坦腹腔注射麻醉后,分别对3组小鼠进行肝脏注射E.m组织混悬液,制备模拟原发性肝多房棘球蚴小鼠模型.结果 3组小鼠的存活率依次为85%、75%、80%(P>0.05),肝脏E.m感染率依次为70.6%、70.0%、62.5%(P>0.05),胸腔误穿率依次为0%、0%、25%(P<0.01).结论 切开皮肤经腹壁肌层肝穿刺接种可成功制备模拟原发性肝多房棘球蚴小鼠模型,既简化了开腹接种的操作,又减少了经皮肝穿刺误穿胸腔的发生率.
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两种棘球绦虫的水通道蛋白基因克隆及功能特性的比较
目的 探索棘球绦虫水通道蛋白(aquaporin,AQP)在棘球蚴、泡球蚴囊液形成中的作用,为阐明棘球蚴、泡球蚴囊液的形成过程以及筛选棘球蚴病新的药物治疗靶点提供理论依据.方法 利用RT-PCR扩增棘球蚴、泡球蚴AQPs基因,构建AQPs体外转录载体,并在非洲爪蟾(Xenopus laevis)卵母细胞中进行异源表达,以验证其水通道功能.利用生物信息学方法分析两种棘球绦虫水通道蛋白跨膜结构域特点及差异,并对棘球绦虫和人AQPs进行多序列比对,分析棘球绦虫AQPs序列结构与人AQPs的差异.结果 通过RT-PCR成功克隆了棘球蚴Eg AQP4和Eg AQP9、泡球蚴Em AQP4和Em AQP9四个基因,注射了这些基因cRNA的卵母细胞与注射DEPC水的对照组卵母细胞的体积变化率(V/V0)差别无统计学意义(F=1.143,P＞0.05),透水系数差别亦无统计学意义(F=1.416,P＞0.05),这四个AQPs基因在非洲爪蟾卵母细胞中未表现出水通道的功能.跨膜结构域预测及多序列比对结果表明,与经典的水通道蛋白相比,Eg AQP4和Em AQP4虽然N和C末端均位于胞质侧,但跨膜结构域数目为4个,NPA基序替换为NPM和NPT;而Eg AQP9和Em AQP9虽然具有2个保守的NPA基序,但跨膜结构域数目为5个,N末端位于胞外侧、C末端位于胞质侧.棘球绦虫AQPs蛋白结构存在的这些差异,可能与其在卵母细胞中未表现水通道蛋白的功能有关.结论 两种棘球绦虫基因组中都存在编码AQPs的基因,但这些AQPs基因的功能验证试验未见到水通道功能.该结果可能正好说明了囊液的水分子既不能通过AQPs进入生发层细胞而致使细胞肿胀坏死,也不能以AQPs为通道从生发层细胞转移出囊壁,致使囊液累积、棘球蚴包囊或泡球蚴囊泡体积长大.
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多房棘球蚴LDH基因的克隆表达及免疫原性研究
目的 克隆表达青海省多房棘球蚴(Echinococcus multilocularis,Em)乳酸脱氢酶(lactate deh ydrogenase,LDH)基因,鉴定EmLDH重组蛋白的免疫原性,初步评价其免疫诊断价值.方法 采用RT-PCR方法克隆EmLDH基因,将其连接入pET15b表达载体中,构建重组表达质粒pET15b-EmLDH,转化至E.coli Rosetta(DE3)感受态细胞进行诱导表达.通过SDS-PAGE检测重组蛋白的表达形式,Ni-IDA树脂亲和层析纯化重组蛋白.通过Western blotting法鉴定EmLDH重组蛋白的免疫原性,ELISA法检测泡型包虫病患者(57例)、囊型包虫病患者(33例)和正常人(50例)血清,初步评价EmLDH重组蛋白的免疫诊断效果.结果 成功克隆了EmLDH基因并表达纯化出相应的重组蛋白.Western blotting结果显示,EmLDH重组蛋白可被泡型和囊型包虫病患者血清识别,而不被正常人血清识别.ELISA结果显示,EmLDH重组蛋白对泡型和囊型包虫病患者血清的诊断敏感性分别为84.21％和84.85％.结论 EmLDH重组蛋白具有较高的免疫原性,对包虫病具有较好的免疫诊断价值.
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微囊法棘球蚴继发感染小鼠动物模型的建立
目的 通过体外培养原头蚴发育成微囊,经腹腔注射建立稳定的细粒棘球蚴和多房棘球蚴继发感染小鼠动物模型.方法 无菌条件下采集羊源细粒棘球绦虫原头蚴和鼠源多房棘球绦虫原头蚴,经胃蛋白酶消化后检测虫体活力并计数,于37℃、5％CO2条件下进行体外培养至发育成微囊,以每鼠50个微囊的剂量经腹腔注射的途径分别接种BALB/c小鼠.接种6个月后,通过腹部解剖大体观察和病理检测分析各组小鼠的感染情况及包虫囊的生长情况.结果 原头蚴在体外培养60d时发育成微囊,显微镜下观察Eg具有明显的透明角质层结构,而Em微囊角质层较薄.小鼠细粒棘球蚴和多房棘球蚴的感染率均为100％,Eg包虫囊为游离单囊,成囊率达70％,囊内无原头蚴;Em包虫囊为类似肿瘤的团块状组织,病灶内有生发囊及原头蚴.结论 采用微囊法可建立稳定的棘球蚴继发感染小鼠动物模型,为疫苗研制、药物筛选和疗效判定提供研究动物模型.
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多房棘球蚴EM18基因片段的克隆与生物信息学预测
目的 寻找EM18抗原表位.方法 用逆转录PCR方法从多房棘球蚴的RNA扩增EM18基因片段,运用各软件对EM18的二级结构和表面特性、亲水性、理化性质、可及性、免疫原性和可塑性等方面进行分析,预测其抗原表位.经3DLigandsite服务器结构预测其编码的蛋白质的3D结构.结果 EM18存在潜在的抗原表位,B细胞表位区域:28-43、49-55、59-64、69-79、85-91、99-111、119-129、135-144.结论 运用生物信息学方法确定EM18存在8个抗原表位,对进一步研究EM18的抗原性和研发优势表位疫苗具有重要的意义.
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基于线粒体COI、NDI和12S rRNA基因序列的包虫病标本的分子分类学研究
目的 克隆一例临床包虫病标本的线粒体基因COI、ND1和12SrRNA的基因序列,在基因水平上对包虫病病原体进行诊断,分析棘球绦虫线粒体基因序列差异.方法 根据GenBank中登录的棘球绦虫线粒体基因COI、NDI和12SrRNA的序列信息分别设计3对引物,扩增临床包虫病标本的COI、NDI和12S rRNA基因,并进行测序.对所克隆的目的基因序列进行BLAST分析并与GenBank中已收录的部分棘球绦虫的COI、NDI和12SrRNA基因序列进行对比分析,并制做系统发生树.结果 从包虫囊液DNA中成功克隆了长度分别为528 bp、1 001 bp和246 bp的基因片段,序列分析表明所克隆的基因片段为多房棘球绦虫的COI、NDI和12S rRNA基因.其中基因COI和NDI可以用于棘球绦虫的种间分类,而基因片段12S rRNA不能用于棘球绦虫的种间分类.结论 从基因水平上确诊了此例包虫病患者的病原体为多房棘球蚴.
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湖北省宜昌市首例肝包虫病治疗及调查报告
包虫病又称棘球蚴病,是棘球绦虫的幼虫寄生在人体内引起的疾病.在我国有两种,即细粒棘球蚴引起的囊型包虫病和由多房棘球蚴引起的泡型包虫病.包虫病是我国北方和西南地区危害人畜的重要寄生虫病,属法定丙类传染病[1].2009年3月湖北省宜昌市第一人民医院报告1例肝包虫病临床诊断病例,宜昌市疾病预防控制中心接到报告后,立即进行了流行病学调查,现将调查结果报告如下.
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B型超声观察丙硫咪唑治疗肝泡状棘球蚴病的疗效
肝泡状棘球蚴病(Hepatic alveolar echinococcosis;HAE)是肝包虫病的一个类型,是一种因多房棘球蚴绦虫幼虫寄生在肝脏引起的险恶寄生虫病.流行区居民称其为"寄生虫肿瘤",患者早期尚能参加劳动和工作,病情发展到中期劳动力明显减退,晚期丧失劳动力进而危及生命.本病在我国主要分布在新疆,甘肃,青海,内蒙古和西藏等地.患者大多远居在牧区,因经济及医疗条件等原因,病情延误就诊时多属中晚期,已失去手术机会.近年来我国采用丙硫咪唑(Albendazole:ABL)治疗包虫病,取得了一定疗效,且因其无明显副作用而广泛应用于临床.本文对96例中晚期患者给予口服丙硫咪唑治疗1年后,进行了B超跟踪观察,现报告如下.
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泡球蚴感染对宿主肝细胞增殖影响的初步研究
目的 探讨泡球蚴感染对宿主肝细胞增殖和细胞周期的影响.方法 8～ 10周龄雌性BALB/c小鼠随机分为实验组和假手术组.分别于感染后2、8、30、60、90d采集小鼠肝脏标本.观察小鼠肝脏病理改变.检测泡球蚴感染不同阶段的增殖细胞核抗原(PCNA)和细胞周期蛋白(cyclins)表达的动态变化及其定位.组间数据比较采用t检验.结果 随着泡球蚴持续感染,实验组病灶与肝细胞交界区出现炎性细胞浸润、脂肪变性和纤维结缔组织增生等病理变化,感染早期(2、8、30 d)病灶周围肝细胞存在细胞核增大、双核或多核细胞增多等现象.感染30、60、90 d,实验组PCNA表达呈上升趋势,阳性率明显高于假手术组(7.01％±1.89％与1.03％±0.52％、8.41％±2.80％与0.93％±0.31％、13.40％±4.43％与1.07％ ±0.94％,t值分别为-6.817,-5.931,-6.102,P值均＜0.05).感染30d和60d时,实验组cyclin D1表达上升,阳性率明显高于假手术组(6.73％±2.52％与0.48％±0.43％、8.22％±3.09％与0.55％±0.34％,t值分别为-5.479,-5.504,P值均＜ 0.05);感染90d时,cyclin D1呈下降的趋势(从“+++”降至“+”).感染30、60、90d时,实验组cyclin A阳性率明显高于假手术组(7.75％±3.05％与0.69％±0.36％、3.42％±1.80％与1.14％±0.42％、3.03％±1.50％与0.69％±0.31％,t值分别为-5.131,-2.774,-3.415,P值均＜ 0.05).感染2、8、30d时,实验组cyclin B1表达呈上升趋势(从“+”升至“++”),感染60、90 d时,cyclin B1表达呈下降趋势(从“++”降至“+”).结论 体内泡球蚴感染促进宿主肝细胞的增殖和抗凋亡,并对其细胞周期产生影响.
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氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果评价
目的 研究氯舒隆和奥硝唑体外抗细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴的效果. 方法 从感染细粒棘球蚴绵羊肝脏中收集原头节;从感染长爪沙鼠腹腔中分离多房棘球蚴,加入预先接种人肝癌细胞的DMEM培养基中培养2个月后,收集直径为1～5 mm囊泡.实验分氯舒隆组(实验组)、奥硝唑组(实验组)、阿苯达唑组(阳性对照)和0.2％二甲基亚砜(DMSO)组(溶剂对照组).每种药物设2个平行孔,终浓度均为40 μmol/L,重复2次.每孔加细粒棘球蚴原头节约100个或多房棘球蚴囊泡25～35个.药物处理细粒棘球蚴原头节24、48、72、96、120、l44和168 h后,显微镜下观察原头节形态,用台盼蓝染色,计算原头节存活率,组间存活率的比较采用方差分析.药物处理多房棘球蚴囊泡36 h和120 h后,显微镜下观察囊泡的形态学改变,测定培养上清液中碱性磷酸酶的活性,组间酶活性的比较采用卡方分析. 结果 氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用于原头节后,原头节颜色变深、钙颗粒减少、头钩脱落、头节外翻并伸长,0.2％ DMSO对原头节形态无影响.氯舒隆、臭硝唑和阿苯达唑作用24、48、72、96、120、144和168 h后,原头节存活率分别为79％、70％、56％、42％、33％、16％、15％,86％、67％、63％、48％、32％、28％、21％和85％、71％、45％、36％、21％、15％、8％;0.2％ DMSO组原头节存活率为100％.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组原头节存活率与0.2％ DMSO组相比差异均有统计学意义(X2=147.83、130.58、170.37,P＜ 0.05).氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑作用后,多房棘球蚴囊泡均塌陷、皱缩,0.2％ DMSO对多房棘球蚴囊泡形态无影响.作用36 h后氯舒隆、奥硝唑、阿苯达唑和0.2％ DMSO组培养上清液碱性磷酸酶的吸光度(A405)值分别为0.196±0.030、0.186±0.004、0.244±0.049和0.131±0.020,作用120 h后分别为0.431±0.006、0.271±0.004、0.423±0.007和0.116±0.004.氯舒隆、奥硝唑和阿苯达唑组与0.2％ DMSO组相比差异均有统计学意义(t=0.006、0.004、0.007,P＜ 0.05). 结论 氯舒隆和奥硝唑对体外培养的细粒棘球蚴原头节和多房棘球蚴均具有较强的作用,是潜在的抗棘球蚴药物.
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肝棘球蚴病11例CT诊断分析
肝棘球蚴病(包虫病),为细粒棘球蚴和多房棘球蚴的寄生虫,寄生于人体引起的一种人畜共患的寄生虫病,也称包虫囊肿和泡型肝包虫病.我国主要流行于发达的畜牧业地区.肝棘球蚴病的CT诊断已有文献报告,泡型肝包虫病发病率低,约为1%～2%[1].本文主要报告资料完整的包虫囊肿病11例,旨在提高对本病的认识.
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多房棘球蚴重组蛋白 CTB_Emy162的原核表达及分离纯化#
目的：构建融合基因 CTB_Emy162原核表达系统，纯化得到多房棘球蚴重组蛋白CTB_Emy162。方法根据多房棘球蚴抗原 Emy162在 GenBank 中的序列，用生物信息学软件OptimumTM Codon 优化密码子适应指数（CAI）、优密码子频率（FOP）及 GC 含量从而获得适合大肠杆菌 BL_21表达的 Emy162基因序列。PCR 扩增 Emy162基因，定向在 pET_28a_CTB 的 CTB 基因5′端插入 Emy162基因。构建 CTB 和 Emy162双基因原核表达质粒 pET28a_CTB_Emy162，将该质粒转化于 E.coli BL_21（DE3）中，经 IPTG 诱导蛋白表达后，利用 Ni_NTA 柱亲和层析及离子交换色谱纯化后获得目的蛋白。结果 OptimumTM Codon 获得优化后的 Emy162序列，经生物公司测序及酶切鉴定结果证明重组质粒 pET28a _ CTB _ Emy162构建成功，进一步实验结果表明CTB_Emy162在原核表达系统 pET_28a 中主要以包涵体形式存在，在可溶部位少量表达。继而经Ni_NTA柱亲和纯化及离子交换色谱纯化获得 CTB _ Emy162纯蛋白。结论以大肠杆菌E.coli BL_21（DE3）及 pET _28a 构成的原核表达系统能够成功表达重组蛋白 CTB _ Emy162， Ni_NTA纯化柱能够纯化目的蛋白 CTB_Emy162。
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多房棘球蚴抗原蛋白 TSP3抗原表位的生物信息学预测#
目的：预测多房棘球绦虫抗原蛋白 TSP3的二级结构和优势抗原表位（T 细胞和 B细胞表位）。方法 Genbank 获取 TSP3的氨基酸序列后通过生物信息学软件 SOPMA 预测二级结构特征，进一步通过在线软件 IEDB、SYFPEITHI、Bcepred 和 ABCpred 预测 TSP3的 T 细胞和 B 细胞表位。同时对 TSP3的亲水性、柔韧性、抗原性及蛋白表面暴露区域的特征进行预测。结果无规则卷曲和β转角分别占 TSP3蛋白质的二级结构的25.68%和4.05%，说明潜在优势抗原性表位存在。通过多种生物信息学方法分析出 TSP3潜在的 T 细胞表位为 T33_42、T45_55、T53_63、T68_77、T80_90、T92_104、T110_122、T134_144；TSP3潜在的 B 细胞表位为 T18_33、T45_55、T53_63、T64_75、T80_90、T92_104、T110_122。结论 TSP3的二级结构特征显示潜在优势抗原性表位存在，预测出8种 T 细胞抗原表位和7种 B 细胞抗原表位，为后续表位疫苗的设计奠定了理论基础。
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多房棘球蚴蛋白TSP3的原核表达及分离纯化
目的 构建适合融合基因pCzn1-TSP3的原核表达系统,纯化获得多房棘球蚴蛋白TSP3.方法 TSP3的基因序列在GenBank中获取,采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法,构建原核表达质粒pCzn1-TSP3,并转化于大肠杆菌Arctic Express (DE3)中,经IPTG诱导,获得目的蛋白,利用Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得目的蛋白.结果 经生物公司测序及酶切鉴定结果证明重组质粒pCzn1-TSP3构建成功.进一步实验结果表明TSP3在原核表达系统中主要以可溶蛋白形式存在.继而经Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱纯化获得TSP3纯蛋白,并经过Western Blot证实.结论 大肠杆菌Arctic Express(DE3)中能够成功表达蛋白TSP3,且Ni-IDA-Sepharose CL-6B亲和层析柱能够纯化目的蛋白TSP3.
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藏药烈香杜鹃挥发油在体外杀伤多房棘球蚴药效研究
目的 明确烈香杜鹃挥发油在体外对多房棘球蚴的杀伤作用.方法 采用水蒸气蒸馏法分离烈香杜鹃叶中的挥发油成分,并以不同的浓度在体外与原头蚴共培养,在光镜下观察原头蚴的死亡率及结构变化.结果 浓度为10 mg/mL的烈香杜鹃挥发油体外培养作用0.75 h后原头蚴的死亡率是99.00±1.000％ (P＜0.001);浓度为5 mg/mL时作用12 h是80.00±2.000％(P＜0.001);浓度为1 mg/mL时作用12h是43.00±2.000％(P＜0.001).扫描电镜观察发现死亡原头蚴体表微绒毛消失,体表受到损伤.结论 烈香杜鹃挥发油在体外对多房棘球蚴具有较强的杀伤作用.
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多房棘球蚴表面抗原EMY162的原核表达及抗体制备
目的 建立多房棘球蚴表面抗原EMY162原核表达系统及制备兔多克隆抗体.方法 构建表达载体pCzn1-EMY162并转入Arctic Express菌株,用IPTG诱导、Ni柱纯化获得目的蛋白后免疫新西兰兔,以ELISA、SDS-PAGE考察纯化后抗体的效价、浓度及纯度.结果 酶切鉴定和测序结果表明重组质粒pCzn1-EMY162构建成功,且EMY162在包涵体部位中表达、可溶部位微量表达.通过Ni-NTA柱亲和层析纯化获得高纯度的EMY162蛋白.免疫兔后收集血清,其ELISA结果表明,抗血清可以特异性结合目标蛋白,抗体效价大于512 K,SDS-PAGE结果表明,纯化后获得了较高纯度的多克隆抗体,可用于后续实验研究.结论 成功建立EMY162原核表达系统并制备了高纯度、高效价的多克隆抗体.
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藏药格尔琼体外杀伤多房棘球蚴药效作用及活性部位的研究
目的 明确藏药组方格尔琼体外对抗多房棘球蚴药效学活性及其活性部位.方法 将格尔琼经醇提、萃取、凝胶柱层析、硅胶柱层析、液相制备等方法分离纯化得到24个不同部位的化合物,将所得化合物以不同的浓度在体外与原头节共培养,光镜下观察原头节死亡率及结构改变.结果 空白组原头节死亡率为13.67±0.577,格尔琼醇提物组为93.67±1.523 (P＜0.0000),阿苯达唑组为47.67±2.08 (P＜0.0000),且格尔琼醇提物组原头节死亡后形态与阿苯达唑组有明显差异.继而对格尔琼醇提物进行萃取分离,获得乙酸乙酯部位、正丁醇部位、石油醚部位三个部分,药效学实验发现乙酸乙酯部位组原头节死亡率为93.67±0.577 (P＜0.0000).对乙酸乙酯部位进行凝胶柱层析分离,获得Fraction1、Fraction2、Fraction3、Fraction4、Fraction5五个部位,药效学实验发现Fraction3组原头节死亡率为97.33±1.528(P＜0.0000).对Fraction3进行硅胶柱层析分离,获得Fraction3.1、Fraction3.2、Fraction3.3、Fraction3.4、Fraction3.5、Fraction3.6、Fraction3.7、Fraction3.8八个部位,药物实验发现Fraction3.1组原头节死亡率为83.00±4.583(P＜0.0000).对Fraction3.1进行液相制备分离,获得Fraction3.1.1、Fraction3.1.2、Fraction3.1.3、Fraction3.1.4、Fraction3.1.5、Fraction3.1.6、Fraction3.1.7七个部位,药物实验发现Fraction3.1.2组原头节死亡率为83.33±3.06 (P＜0.0000).结论 格尔琼相比阿苯达唑对体外多房棘球蚴具有较强的杀伤作用,其活性组分为大分子非极性化合物.
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青南高原多房棘球蚴myophilin基因的克隆和序列分析
目的 克隆多房棘球绦虫(Em)的myophilin基因并对其序列进行分析与预测.方法 提取Em原头节总RNA,采用RT-PCR技术扩增myophilin基因,将PCR产物连接入pGM-T载体,转化入DH 5α感受态细胞,挑选阳性克隆送测序.采用生物信息学软件对测序结果进行序列比对分析,同时预测编码蛋白的理化性质、二级结构、三级结构、翻译后修饰位点、结构域和抗原表位.结果 扩增出长度为576 bp的cDNA片段,包含完整开放阅读框(ORF),编码190个氨基酸,与已知细粒棘球绦虫的序列同源性达99％.预测结果显示,编码蛋白分子式为C935 H1519 N2550285S11,理论分子质量为212 876,PI为8.66.α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲在二级结构中所占的比例分别为51.58％、10.00％和38.42％.含有10个翻译后修饰位点,各1个Calponin结构域和CH结构域,8个B细胞抗原表位和6个T细胞抗原表位.结论 成功克隆出Em的myophilin基因并对其进行了有效分析和预测.
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伊宁县阿恰勒发现伊犁田鼠感染多房棘球蚴
以新疆尼勒克县孟玛热勒林场发现伊犁田鼠(Microtus ilaeus)感染多房棘球蚴(Echinococcus maltilocularis)为线索,伊犁州鼠防监测组2000年6月～8月对伊宁县阿恰勒的科库尔琴和库尔赛塔乌勒山间沟谷进行了伊犁田鼠感染多房棘球蚴调查.该谷地南部和孟玛热勒林场博尔博松沟相连,北部与精河县大河沿子冬草场毗邻,调查地区位于北纬44°13′～44°17′,东经82°00′～82°15′,海拔高度在1 800～2 400m之间.伊犁田鼠多分布在沟谷冲积坡黑土层,鼠密度相对较高并呈点状分布技于牧民牛羊圈附近或与长尾黄鼠共处同一栖息地.
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异丙肌苷及其主要成分抗多房棘球蚴作用的体外研究
为研究异丙肌苷和其主要成分肌苷在体外抗多房棘球蚴和原头节的效果,运用RPMI1640作培养基体外培养原头节,后加入异丙肌苷或肌苷,使培养基中的药物浓度分别为1mM,2mM,4mM,连续培养9d,结果没有发现异丙肌苷和肌苷对多房棘球蚴的原头节和小囊有杀灭作用,所以尚不能认为异丙肌苷具有杀灭多房棘球蚴的直接作用.
