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转化生长因子β1增强糖酵解促进舌鳞状细胞癌细胞上皮间充质转化及迁移与侵袭
目的 研究转化生长因子β1(TGF-β1)对舌鳞状细胞癌(TSCC)糖酵解活性和上皮间充质转化(EMT)及迁移与侵袭的影响.方法 利用10 ng/mL TGF-β1处理TSCC SCC9细胞1、2、3 d,收集细胞上清液检测葡萄糖和乳酸表达变化;蛋白免疫印迹法(Western blot)检测TGF-β1处理1、2、3 d后糖酵解关键酶表达变化;应用10 ng/mL TGF-β1处理TSCC SCC9细胞2、4、6 d,在倒置显微镜下定时观察细胞形态;Western blot检测TGF-β1诱导2、4、6 d后EMT上皮标记蛋白E-cadherin、间质标记蛋白Vimentin、Snail和Slug的表达变化;Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力;同等培养条件下未经TGF-β1处理的为对照组.SPSS 13.0统计软件进行数据分析.结果 在TGF-β1诱导条件下,TSCC SCC9细胞葡萄糖摄取量在2和3 d时[(34.1 ± 1.2)、(47.1 ± 2.3)mmol]较对照组显著升高(t2 d=17.941, P2 d=0.003;t3 d=24.430,P3 d=0.002),同时SCC9细胞乳酸生成量在2和3 d时[(46.4 ± 1.0)、(60.2 ± 2.0)mmol]较对照组明显增加(t2 d=50.230,P2 d=0.005;t3 d=26.883,P3 d=0.004);TGF-β1处理后,糖酵解关键酶HK2表达在2和3 d时(1.21 ± 0.04、1.30 ± 0.06)均高于对照组,差异有统计学意义(t2 d=6.111, P2 d=0.026;t3 d=6.423,P3 d=0.023);糖酵解关键酶PKM2表达在2和3 d时(1.048 ± 0.002、1.071 ± 0.010)与对照组相比,差异无统计学意义(t2 d=20.693,P2 d=0.072;t3 d=9.875,P3 d=0.081);糖酵解关键酶PFKP在2和3 d时(0.820 ± 0.010、0.839 ± 0.036)表达较对照组明显升高(t2 d=21.829,P2 d=0.020;t3 d=9.853,P3 d=0.022);糖酵解关键酶GLUT1表达在2和3 d时(0.503 ± 0.007、0.589 ± 0.019)均高于对照,差异具有统计学意义(t2 d=30.693,P2 d=0.015;t3 d=21.173,P3 d=0.012).在TGF-β1诱导下,与对照组相比,TSCC SCC9细胞从鹅卵石状变为长梭形,同时EMT上皮标记蛋白E-cadherin表达在2、4和6 d时(0.69 ± 0.03、0.67 ± 0.04、0.65 ± 0.04)较对照组降低,差异有统计学意义(t2 d=7.187,P2 d=0.019;t4 d=6.631,P4 d=0.022;t6 d=6.690,P6 d=0.022),间质标记蛋白Vimentin(1.089 ± 0.134、0.706 ± 0.025、0.620 ± 0.010)表达在2、4、6 d处与对照组相比表达升高(t2 d=6.948,P2 d=0.020;t4 d=16.710,P4 d=0.004;t6 d=6.157,P6 d=0.025),EMT转录因子snail在2 d时(1.14 ± 0.17)表达与对照组(0.77 ± 0.10)相比表达升高(t=3.794,P=0.015),EMT转录因子slug在2 d时(1.85 ± 0.11)表达与对照组(0.93 ± 0.02)相比表达升高(t=15.385,P=0.014);与对照组(20.0 ± 2.0)相比,TGF-β1处理后细胞迁移能力(45.7 ± 11.6)显著增加(t=4.529,P=0.017),细胞侵袭能力(58.7 ± 5.0)较对照组(22.3 ± 1.5)明显升高(t=15.571,P=0.015).结论 TGF-β1增强糖酵解,并促进TSCC细胞EMT及迁移和侵袭.
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CXC受体4阳性表达骨髓间充质干细胞的分选及其骨向分化的能力
目的 研究磁珠分选法分选表面CXC受体4(CXCR4)阳性表达的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSC)的分选效率,以及分选后BMSC的增殖、迁移和成骨能力是否受到影响.方法 全骨髓贴壁法分离培养大鼠BMSC,通过生长曲线、成骨成脂诱导分化和流式检测BMSC表面标记蛋白表达,鉴定大鼠BMSC.流式检测细胞表面CXCR4的阳性率,通过生长曲线及克隆形成实验检测细胞的增殖活性及克隆形成能力,Transwell体外趋化实验检测细胞迁移能力,通过检测成骨诱导早期细胞ALP活性和成骨相关基因的表达,分析细胞成骨能力,数据采用单因素方差分析处理.结果 通过全骨髓贴壁法获得具有自我更新和多向分化能力的大鼠BMSC.磁珠分选阳性细胞表面CXCR4表达[(55.13±0.67)％]较未分选组[(6.49±0.59)％]显著增加(LSD-t=63.66,P<0.001).分选阳性细胞的克隆形成能力[(16.22±1.68)％]以及培养后期细胞增殖活性(A450(5 d)=1.40±0.04;A450(7 d)=1.60±0.01)较未分选细胞[CFU=(17.00±1.76)％;A450(5 d)=1.49±0.07;A450(7 d)=1.60±0.12]均无明显变化;而培养早期(第1、3天)分选阳性细胞的增殖活性[A450(1 d)=0.50±0.01;A450(3 d)=0.81±0.05]较未分选细胞[A450(1 d)=0.57±0.01;A450(3 d)=0.96±0.06]稍低[LSD-t1 d=5.208,P1 d=0.002;LSD-t3 d=3.563,P3 d=0.012].分选阳性细胞的基质细胞衍生因子1α(SDF-1α)定向迁移能力(71.33±5.69)较未分选细胞(23.33±1.53)显著增强(LSD-t=17.211,P<0.001).在成骨诱导早期,分选阳性细胞的Runx2 mRNA(0.93±0.12)较未分选组(0.51±0.14)表达上调(LSD-t=4.703,P=0.003),而ALP活性及ALP mRNA、OCN mRNA的表达均无明显变化(P>0.05).结论 磁珠分选法可有效分选CXCR4+BMSC,显著提高BMSC向SDF-1α的迁移效率,对细胞的增殖活性影响不大.
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人牙髓细胞来源外泌体对脐静脉内皮细胞迁移能力的影响
目的 探讨牙髓细胞外泌体(DPC-Exos)对脐静脉内皮细胞(HUVEC)迁移能力的影响.方法 超速离心法分离提纯DPC-Exos,透射电镜和蛋白印迹法(Western blot)进行鉴定;划痕实验和Transwell实验检测DPC-Exos对HUVEC迁移的影响.采用SPSS 20.0软件进行分析,划痕实验迁移率和Transwell实验细胞迁移数采用两独立样本的t检验进行统计.结果 DPC-Exos呈双层膜包被和茶托样结构,表达CD63膜蛋白标记物.划痕实验结果显示,DPC-Exos作用6 h后HUVEC细胞迁移能力下降26%,差异具有统计学意义(t=6.534,P<0.001).Transwell实验结果显示,DPC-Exos作用6 h后HUVEC迁移能力下降32%,差异具有统计学意义(t=5.846,P<0.001).结论 DPC-Exos抑制HUVEC迁移.
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漆树酸对人卵巢癌细胞侵袭转移的影响
目的 研究漆树酸(anacardic acid,AA)对人卵巢癌细胞的作用,并初步探讨其作用机制.方法 选取两种卵巢癌细胞(SKOV3和HO8910),设置对照组及漆树酸终浓度为2.5μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L的漆树酸组,采用MTT法检测漆树酸对细胞增殖的影响;Transwell检测漆树酸对卵巢癌细胞迁移侵袭能力的影响;鬼笔环肽染色检测细胞侵袭伪足形成并进行细胞划痕修复实验;RT-PCR和Western blotting检测漆树酸10μmol/L、15μmol/L组PI3K、VEGF及Caspase3的mRNA及蛋白表达水平变化.结果 随AA浓度增加,SKOV3和HO8910细胞株24 h光密度值均呈增加趋势(P＜0.05).AA作用24 h后,10μmol/L、15μmol/L组的SKOV3和HO8910与对照组相比,增殖活性明显增强(P＜0.05),与对照组比较,PI3K和VEGF的mRNA及蛋白表达明显上调(P＜0.05),而Caspase3的mRNA及蛋白表达降低(P＜0.05).结论 漆树酸可能通过调节PI3K、VEGF、Caspase3信号通路,促进卵巢癌细胞增殖,诱导细胞侵袭迁移,侵袭伪足形成.
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RIP140过表达对神经母细胞瘤细胞迁移及增殖的影响
目的：探讨受体相互作用蛋白140（ RIP140）过表达对小鼠神经母细胞瘤细胞（ N2a细胞）迁移和增殖的影响。方法采用脂质体转染法将RIP140过表达质粒导入N2a细胞，经G418筛选出稳定过表达RIP140的细胞系，利用实时定量PCR及Western 印迹法对构建的细胞模型进行鉴定；分别采用Transwell小室和活细胞计数试剂盒（CCK）8检测RIP140过表达对N2a细胞迁移和增殖的影响。结果将RIP140过表达质粒导入N2a细胞，成功构建RIP140过表达的 N2a细胞模型N2a-rip140，与N2a细胞相比，N2a-rip140细胞中RIP140 mRNA及蛋白表达量均增高。迁移检测显示N2a细胞迁移数明显高于N2a-rip140细胞[（70±20）个比（5±4）个， P＜0.05]。细胞增殖检测显示N2a细胞在24、48、72 h的增殖率分别为1.567±0.107、3.018±0.212、4.112±0.221，而N2a-rip140细胞为1.561±0.281、2.232±0.235、4.025±0.217，两种细胞在3个时间点的增殖率差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论 RIP140过表达抑制N2a细胞的迁移行为，但不影响其增殖行为。
关键词： 神经母细胞瘤 细胞迁移分析 细胞增殖 受体相互作用蛋白140 -
PM2.5对人绒毛膜外滋养层细胞HTR8-SVneo迁移与侵袭力的影响及机制研究
目的:探讨PM2.5对人绒毛膜外滋养细胞HTR8-SVneo存活率以及迁移与侵袭能力的影响,寻找PM2.5致不良妊娠结局可能的机制.方法:不同浓度PM2.5染毒HTR8-SVneo细胞建立实验模型,CCK8(Cell Counting Kit-8)法分析细胞增殖情况,终选取0、30、60、120和200 μg/mL 5个浓度进行后续实验,其中以0μg/mL染毒组为对照组.激光全息细胞分析及成像系统分析细胞迁移力;Transwell侵袭实验分析细胞侵袭力;qPCR和Western Blot分别检测基质金属蛋白酶2(MMP2)、MMP9及其组织抑制剂TIMP1、TIMP2的mRNA和蛋白表达水平;明胶酶谱法检测细胞分泌的明胶酶MMP2和MMP9活性.结果:PM2.5对HTR8-SVneo细胞增殖有显著抑制作用(P＜0.05);PM2.5使HTR8-SVneo细胞迁移距离和穿膜细胞数均减少(P＜0.05);qPCR和Western Blot结果显示,PM2.5使HTR8-SVneo细胞MMP2、MMP9、TIMP1及TIMP2的mRNA及蛋白表达水平升高(P＜0.05),且MMPs升高程度低于TIMPs;明胶酶谱结果显示,HTR8-SVneo细胞MMP9活性在30、60、120和200 μg/mL染毒组均升高(P＜0.05).结论:PM2.5在造成HTR8-SVneo细胞损伤的同时,可能通过打破MMPs/TIMPs的动态平衡影响人绒毛膜外滋养细胞HTR8-SVneo的迁移与侵袭力,从而造成不良妊娠结局,而具体信号机制有待深入研究.
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Ruxolitinib对JAK2V617F阳性骨髓增殖性肿瘤细胞基质金属蛋白酶调控的研究
目的 探讨JAK2抑制剂Ruxolitinib对JAK2V617F突变阳性的骨髓增殖性肿瘤(MPN)细胞内基质金属蛋白酶(MMP)调控的影响.方法 ①收集2012年1月到2015年12月保定市第一医院收治的40例未经治疗的JAK2V617F阳性MPN患者,以15名健康志愿者为对照组.免疫组化法检测两组骨髓活检组织中磷酸化JAK2 (p-JAK2)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9的表达水平.选取JAK2V617F阳性MPN患者骨髓细胞,体外应用Ruxolitinib干预,测定干预前后细胞迁移力和MMP-2、MMP-9表达.②不同浓度Ruxolitinib(0、50、100、250、500、1 000 nmol/L)作用于人红白血病细胞株HEL细胞不同时间后CCK-8检测细胞活力,Tanswell小室检测细胞迁移,荧光定量PCR检测JAK2、MMP-2、MMP-9 mRNA水平变化,Western blot检测p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达.结果 ①MPN组p-JAK2、MMP-2、MMP-9蛋白表达均高于对照组[(78.56+24.55)％对(41.59±17.29)％、(48.25±18.74)％对(22.79±13.89)％、(53.29±19.28)％对(15.56±14.96)％,JP值均＜0.05].Spearman相关分析显示MMP-2、MMP-9蛋白水平与JAK2V617F突变量呈正相关(r=0.526,P=0.001;r=0.543,p=0.001).②Ruxolitinib能够呈时间和剂量依赖性抑制HEL细胞增殖.③迁移实验结果显示5 nmol/LRuxolitinib作用MPN原代细胞及HEL细胞24 h后迁移至下室细胞数均少于无Ruxolitinib组(154.7±27.5对320.3±67.3,t=13.47,P=0.001;70.7±10.5对135.3±16.7,t=13.89,P=0.001).④JAK2、MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白表达随Ruxolitinib剂量增加而降低.结论 Ruxolitinib通过调控JAK2信号通路抑制MMP-2、MMP-9表达而抑制MPN细胞迁移能力.
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中性粒细胞碱性磷酸酶对中性粒细胞功能影响的体外研究
目的 探讨中性粒细胞碱性磷酸酶(neutrophils alkaline phosphatase,NAP)对中性粒细胞迁移、活性氧(ROS)生成以及凋亡的影响.方法 通过慢病毒感染人早幼粒细胞白血病细胞株HL-60获得NAP高表达细胞株,采用RT-PCR和Western blot技术分别检测感染后细胞NAP的基因转录及蛋白表达水平.HL-60细胞经1.5％ DMSO体外诱导分化为类中性粒细胞后进行相关实验:分别利用Transwell迁移实验和流式细胞术检测高表达NAP中性粒细胞的迁移及ROS生成能力;流式细胞术检测细胞凋亡;Western blot法检测高表达NAP中性粒细胞中凋亡相关蛋白Bax、caspase-3和caspase-9的表达情况.结果 经慢病毒感染的HL-60细胞通过嘌呤霉素筛选后80％以上细胞可见绿色荧光,且NAP在基因及蛋白水平表达均明显升高.HL-60细胞经1.5％ DMSO体外诱导分化5d后,细胞体积变小、表面出现许多突起,核质比例降低,核仁消失,核染色质由密集趋向疏松,细胞核扭曲折叠呈杆状或分叶,CD11b+细胞百分比明显升高.Transwell迁移实验结果显示,高表达NAP的中性粒细胞迁移细胞数多于阴性对照组[(15.30±3.65)×103对(8.00±0.78)×103,P＜0.001].流式细胞术检测结果表明,高表达NAP的中性粒细胞胞内ROS的平均荧光强度高于阴性对照组(355.70±20.10对103.22±4.71,P＜0.001);与阴性对照组比较,高表达NAP中性粒细胞胞凋亡率及凋亡相关蛋白Bax、active-caspase-3以及active-caspase-9的表达水平明显上调.结论 NAP具有促进类中性粒细胞迁移及ROS生成、加速细胞凋亡的生物学作用.
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子宫内膜异位症和细胞迁移
子宫内膜异位症(EMs)是常见妇科疾病,其病因仍未清楚.预防EMs的发生是当前备受关注的课题之一.子宫内膜组织细胞迁移是EMs患者异位病灶形成的前提条件,调节子宫内膜细胞的迁移很可能会影响子宫内膜组织异位病灶的形成.深人了解细胞迁移和EMs形成间的相关机制非常重要.综述国内外关于子宫内膜组织细胞迁移的研究方法以及正常人群和EMs患者子宫内膜组织细胞的迁移能力的差异及其可能机制等相关研究,以期为EMs的预防提供思路.
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MTA1沉默抑制鼻咽癌转移能力的体外研究
目的：探究MTA1基因敲除后对鼻咽癌细胞株5-8F细胞转移能力的影响。方法设计并构建针对MTA1基因的RNAi片段，脂质体（LipofectamineTM2000）介导Si-MTA1-01（Si-MTA1-01组）和Si-MTA1-02（Si-MTA1-02组）感染5-8F细胞，同时设无义序列转染组（Si-ctr组）为对照。应用荧光定量PCR和蛋白印迹法检测转染后各组细胞的MTAl mRNA和蛋白表达；细胞划痕实验、基底膜侵袭实验和细胞黏附实验检测转染后5-8F细胞迁移和侵袭能力的变化，并进行比较分析。结果与Si-ctr组相比，Si-MTA1-01和Si-MTA1-02组MTA1 mRNA及蛋白表达水平下降，穿膜细胞数减少，细胞黏附率增加（均P<0.05），划痕实验显示细胞阻滞效果明显。结论沉默MTA1能明显减弱鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力，MTA1有望成为治疗鼻咽癌的有效靶点。
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重组人白细胞介素-11对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响
目的 观察重组人白细胞介素-11(rhIL-11)对肺腺癌A549细胞增殖、迁移和侵袭的影响,并初步探讨其影响机制.方法 分别以0、10、20、50、100μg/L终浓度的rhIL-11作用于A549细胞,MTT法测定A549细胞增殖程度;用0、10、40、80μg/L终浓度的rhIL-11作用于A549细胞,划痕实验和Transwell侵袭实验测定A549细胞的迁移和侵袭能力;Western blot检测基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9蛋白水平的表达.结果 rhIL-11对A549细胞增殖能力无影响;rhIL-11作用于A549细胞后,细胞的迁移和侵袭能力显著增强;rhIL-11能显著上调MMP-2和MMP-9的表达,且表达随rhIL-11浓度的增高而增高(P<0.05).结论 rhIL-11能够促进A549细胞的迁移和侵袭,促进MMP-2、MMP-9上调为其可能的机制之一.
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甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭迁移的影响及其机制研究
目的 检测甲基转移酶SETDB2对肝癌侵袭转移的影响并探讨其机制.方法 应用Western blot、免疫组化以及Real-time PCR等方法检测37例肝癌及对应癌旁组织标本中SETDB2蛋白及mRNA表达情况.将靶向SETDB2的短发卡RNA(sh-SETDB2)和空载体(sh-NC)分别转染至人肝癌MHCC97H细胞构建稳转细胞系,应用Tanswell侵袭实验、细胞划痕实验检测2组细胞的侵袭和迁移能力.通过基因芯片检测敲低SETDB2后表达有变化的基因.敲低SETDB2后,运用Real-time PCR检测PTEN的mRNA的表达变化以及Western blot检测PTEN和组蛋白H3第9位赖氨酸的三甲基化(H3K9me3)的表达变化,CHIP检测H3K9me3在PTEN的启动子区域的变化.在敲低SETDB2的同时敲低PTEN的表达,Tanswell侵袭实验检测细胞侵袭能力的变化.结果 (1)Western blot和Real-time PCR的结果均表明肝癌组织中SETDB2蛋白及mRNA表达水平均高于癌旁组织;SETDB2表达的高低与肝癌组织学分级和TNM分期有关.(2)转染sh-SETDB2的MHCC97H细胞的侵袭和迁移能力均明显低于sh-NC组.(3)基因芯片、Western blot以及Real-time PCR等实验结果显示敲低SETDB2后PTEN表达上调.(4)在敲低SETDB2后H3K9me3表达下调,PTEN启动子区域的H3K9me3减少.(5)与敲低SETDB1组相比,敲低SETDB2的同时敲低PTEN后细胞的侵袭能力恢复.结论 SETDB2通过下调PTEN的表达促进肝癌细胞的侵袭迁移.
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YY1基因在肺癌组织中的表达及其对肺癌细胞功能的影响
目的：检测转录因子YY1在肺癌组织中的表达情况，并分析其对肺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的影响。方法应用Taqman探针实时荧光定量PCR方法检测235例肺癌组织以及62例配对癌旁组织中YY1 mRNA的表达，并分析其表达与患者临床病理特征的关系。应用Lipofectamine 3000试剂在肺癌细胞系转染YY1过表达质粒及对照质粒。噻唑蓝（MTT）分别检测对照组和YY1过表达组在24、48及72 h时A549和H1299细胞增殖能力的变化。划痕实验和Transwell实验检测YY1过表达对肺癌细胞的迁移和侵袭能力的影响。结果与癌旁组织（5.80±0.58）相比，YY1 mRNA在肺癌组织（5.07±0.58）中表达下调（P<0.01），且YY1 mRNA的表达在不同性别、吸烟状态、病理类型及临床分期中差异有统计学意义（P<0.05）。YY1过表达组H1299细胞增殖能力在48 h和72 h均低于对照组（P<0.01），A549细胞在72 h低于对照组（P<0.05）。划痕实验和Transwell实验结果显示转染过表达YY1质粒后，肺癌细胞的侵袭能力及迁移能力明显下降（P<0.05）。结论 YY1在肺癌组织中低表达，上调YY1的表达可抑制肺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
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Fractalkine/CX3CR1参与骨髓间充质干细胞向缺血脑组织定向迁移的实验研究
目的 观察fractalkine及其受体CX3CR1是否参与介导大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)向缺血脑组织的定向迁移.方法 密度梯度离心贴壁筛选法分离纯化BMSCs.利用RT-PCR和免疫组化方法检测BMSCs对CX3CR1的表达.建立大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型.使用Transwell小室建立体外趋化迁移模型,观察fractalkine和缺血脑组织萃取液是否诱导BMSCs定向迁移,以及阻断CX3CR1对BMSCs向缺血脑组织萃取液迁移的影响.结果 获得了纯化的BMSCs;BMSCs均一地表达CD44、CD90和CD71,在重组fractalkine浓度为200 ng/ml和500 ng/ml实现迁移的BMSCs与对照组相比有显著差异(P＜0.05);以CX3CR1抗体阻断BMSCs向缺血脑组织迁移组与正常对照组比较有显著差异(P＜0.05).结论 fractalkine及其特异性受体CX3CR1参与介导BMSCs向缺血脑组织的定向迁移.
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SPK1调控人脐静脉内皮细胞SIRT1表达及细胞迁移的机制研究
目的 探讨鞘氨醇激酶1(sphingosine kinase1,SPK1)调控沉默信息调节因子1(silent mating type infor-mation regulation 2 homolog 1,SIRT1)表达及对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)迁移能力的机制.方法 用病毒感染复数(MOI)=20的pLKO.1-shSPK1-GFP干涉慢病毒(shSPK1组)和pPIG-U6-Scramble-GFP对照慢病毒(GFP-SC组)感染HUVECs,48 h后提取细胞蛋白并用蛋白免疫印迹法检测ERK、P38 MAPK及AKT磷酸化水平.分别用PD98059、SB203580及Wortmannin处理HUVECs 1 h,检测ERK、P38 MAPK及AKT信号表达及SIRT1蛋白表达情况.取抑制剂干预后的细胞进行Transwell小室迁移实验,检测细胞迁移能力.结果 shSPK1组ERK、P38 MAPK及AKT的磷酸化水平均低于GFP-SC组(P ＜0.05,P＜0.01).PD98059、SB203580及Wortmannin组ERK、P38 MAPK、AKT磷酸化水平及SIRT1蛋白表达水平低于对照组,HUVECs的迁移能力较对照组弱(P＜0.01).结论 SPK1可以通过ERK、P38 MAPK及AKT通路调控HUVECs SIRT1的表达及迁移能力.
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葛根素对激素非依赖性前列腺癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用
目的:探讨葛根素对激素非依赖性前列腺癌细胞增殖、凋亡及迁移的影响及其可能的作用机制.方法:应用CCK-8法和FCM法分别检测葛根素对前列腺癌PC3细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响,应用Transwell小室法检测葛根素对前列腺癌PC3细胞迁移和侵袭的影响,应用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法分别检测葛根素对前列腺癌PC3细胞中凋亡相关基因和蛋白表达及蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)活性的影响.结果:与未干预的对照组相比,不同浓度的葛根素可显著抑制PC3细胞的增殖(P值均＜ 0.05),诱导其凋亡(P值均＜0.01),并可将PC3细胞阻滞于G2/M期(P值均＜0.05),亦可有效抑制PC3细胞的迁移和侵袭(P值均＜ 0.01).不同浓度葛根素处理组PC3细胞中磷酸化Akt(phospho-Akt,p-Akt)蛋白(P值均＜0.01)及抗凋亡分子Bcl-2(B-cell lymphoma-2)mRNA (P值均＜0.05)和蛋白(P值均＜0.01)的表达水平均明显低于对照组,促凋亡分子Bax(Bcl-2-associated X)mRNA (P值均＜0.05)和蛋白(P值均＜ 0.01)、Fas (factor associated suicide) mRNA (P值均＜0.01)、caspase-3 mRNA (P值均＜0.01)、cleaved caspase-3蛋白(P值均＜0.01)及caspase-8 mRNA (P值均＜0.01)的表达水平均高于对照组.结论:葛根素具有抑制激素非依赖性前列腺细胞增殖、迁移及侵袭的作用,并可通过上调caspase-3的活性,促进细胞凋亡.
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微RNA-378促进肾癌细胞增殖和迁移及其机制研究
目的:探讨微RNA-378(microRNA-378,miR-378)对肾癌细胞体外增殖和迁移能力的影响,以及其可能的作用机制.方法:利用TCGA (The Cancer Genome Atlas)数据库分析肾癌和正常肾上皮组织中miR-378的表达情况.采用实时荧光定量PCR法检测人肾癌细胞系786-O、ACHN、769-P和Caki-1,以及人肾小管上皮细胞系HK2中miR-378的表达情况.人工合成miR-378模拟物(mimic)和抑制子(inhibitor),并将它们分别转染肾癌786-O和Caki-1细胞,然后分别采用CCK-8法、Transwell小室法和划痕愈合实验检测miR-378对肾癌细胞增殖和迁移的影响.通过生物信息学方法分析miR-378的靶基因,并采用实时荧光定量PCR及蛋白质印迹法进行验证.结果:肾癌组织和肾癌细胞系中miR-378表达均明显上调(P值均＜0.001).miR-378 mimic转染后,肾癌786-O细胞的体外增殖(P＜0.01)和迁移(P＜0.001)能力均明显增强;而miR-378 inhibitor转染后,肾癌Caki-1细胞的体外增殖(P＜0.01)和迁移(P＜0.001)能力均明显减弱.肾癌中miR-378的靶基因可能是大型肿瘤抑制因子2(large tumor suppressor 2,LATS2),肾癌786-O和Caki-1细胞中LATS2 mRNA和蛋白表达水平与miR-378水平均负相关(P值均＜0.01).结论:miR-378过表达可增强人肾癌细胞的增殖和迁移能力,其机制可能与负调控LATS2表达有关.
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微环境中S100A6直接和间接促进结直肠癌LoVo细胞迁移
目的:深入探讨微环境中S100A6对结直肠癌LoVo细胞迁移的作用及其可能的分子机制.方法:制备并鉴定重组蛋白谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)和融合蛋白GST-人S100A6 (GST-human S100A6,GST-hS100A6).用GST-hS100A6(终质量浓度为30 μg/mL)处理LoVo细胞后,采用划痕愈合实验检测细胞的迁移能力变化,采用蛋白质印迹法检测LoVo细胞中总蛋白激酶B(protein kinase B,PKB,又称Akt)和磷酸化Akt(phosphorylated Akt,p-Akt)的表达变化.分别用磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/Akt信号通路抑制剂LY294002和GST-hS100A6单独或联合处理LoVo细胞后,采用划痕愈合实验检测细胞迁移情况.用GST-hS100A6刺激LoVo细胞后的条件培养液(CM-A6-LoVo)处理巨噬细胞,然后采用实时荧光定量PCR法检测该巨噬细胞中M2型标志物CD206和M1型标志物诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表达水平;进一步将该巨噬细胞与LoVo细胞共培养后,采用划痕愈合实验检测LoVo细胞的迁移能力.结果:成功获得GST-hS100A6和GST蛋白(作为对照).与GST组相比,GST-hS100A6处理后的LoVo细胞划痕愈合率明显升高(P＜0.05),而且LoVo细胞中p-Akt蛋白表达明显上调(P＜0.05).与单独GST-hS100A6处理组相比,LY294002联合GST-hS100A6处理后LoVo细胞的划痕愈合率明显降低(P＜0.05).与GST-hS100A6组相比,CM-A6-LoVo条件培养液处理后的巨噬细胞中CD206表达水平升高(P＜0.05),而iNOS表达无明显变化(P＞0.05);并且该巨噬细胞与LoVo细胞共培养可明显提高LoVo细胞的划痕愈合率(P＜0.05).结论:微环境中S100A6可直接和间接地促进结直肠癌LoVo细胞迁移,该作用机制可能与调控PI3K/Akt信号通路以及诱导巨噬细胞向M2型分化有关.
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沉默DLX4基因表达可抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭
目的:探讨抑制DLX4 (distal-less homeobox 4)基因的表达对人前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及其可能的作用机制.方法:分别采用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测人前列腺癌 LNCap、DU145和PC-3细胞中DLX4 mRNA和蛋白的表达水平.将 DLX4 shRNA重组慢病毒pLKO.1-puro-shDLX4感染PC-3细胞(称为 PC-3-shDLX4细胞)后,应用实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法分别验证DLX4的敲除效果,应用MTT法和Transwell小室法分别检测PC-3-shDLX4细胞的增殖、迁移和侵袭能力,应用蛋白质印迹法检测PC-3-shDLX4细胞中上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)相关标志物E-钙黏蛋白(E-cadherin)和波形蛋白(Vimentin)以及参与调控EMT的重要转录因子Snail和Twist蛋白的表达水平.结果:DLX4 mRNA和蛋白在人前列腺癌LNCap、DU145和PC-3细胞中均有较高水平的表达,PC-3细胞中DLX4 mRNA和蛋白的表达水平均高于LNCap和DU145细胞(P值均＜0.05).重组慢病毒pLKO.1-puro-shDLX4感染PC-3细胞后,PC-3细胞中DLX4基因表达被有效沉默, PC-3-shDLX4细胞中DLX4 mRNA和蛋白的表达水平均明显下调(尸值均＜0.05).PC-3-shDLX4细胞的增殖能力未发生明显改变(P＞0.05),而其迁移及侵袭能力却明显下降(P值均＜0.05).PC-3-shDLX4细胞中 Vimentin蛋白的表达水平明显下调(P＜0.05),而E-cadherin蛋白的表达水平明显上调(P＜0.05);参与调控EMT的Snail和Twist蛋白表达水平在PC-3-shDLX4细胞中亦明显下调(P值均＜ 0.05).结论:DLX4在前列腺癌细胞中表达水平较高,下调DLX4表达可能通过逆转Snail和Twist介导的EMT来抑制前列腺癌PC-3细胞的迁移和侵袭.
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AZD5363抑制乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖和迁移并诱导细胞凋亡
目的:探讨蛋白激酶B(又称Akt)抑制剂AZD5363对人乳腺癌MDA-MB-231细胞增殖、迁移和凋亡的影响,并探讨其可能的分子作用机制.方法:用不同浓度(0.5、1、5、10、20和50 μmol/L)的AZD5363处理MDA-MB-231细胞后,采用MTT法检测细胞增殖活力,FCM法分析细胞周期的变化,划痕愈合实验和Transwell小室法检测细胞迁移能力的变化,TUNEL法测定细胞凋亡率,蛋白质印迹法检测细胞周期和凋亡相关蛋白的表达水平变化.结果:AZD5363可抑制MDA-MB-231细胞的增殖活力(P＜0.05),并呈剂量依赖性;AZD5363可通过上调p53表达和下调cyclin B1表达(P值均＜0.05),阻滞细胞周期于S期(P＜0.05).AZD5363能够明显抑制MDA-MB-231细胞的迁移(P＜0.05),同时诱导MDA-MB-231细胞发生凋亡(P＜0.05),其分子机制可能与AZD5363促进caspase-3和多聚ADP-核糖聚合酶[poly (ADP-ribose) polymerase,PARP]的剪切活化相关(P值均＜0.05).结论:AZD5363能够抑制细胞增殖和迁移,同时诱导MDA-MB-231细胞凋亡,从而表现出抗肿瘤活性.
