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Ⅰ、Ⅱ型胶原酶分离心肌细胞的效果比较及分析
目的 比较Ⅰ型和Ⅱ胶原酶对大鼠心肌细胞分离的分离效果,并对其成因进行分析.方法 利用Ⅰ、Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,比较两种酶对心肌细胞的分离效果;采用免疫组织化学、免疫荧光和Western blotting技术检测成年大鼠心肌组织中是否存在Ⅱ型胶原;用大鼠剑突软骨部组织的Ⅱ型胶原和心肌组织的Ⅲ型胶原作为阳性对照;用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测Ⅱ型胶原酶试剂的成分.结果 Ⅰ、Ⅱ型胶原酶分别消化心肌组织,所获心肌细胞数量分别为(5.66±0.83)×106和(5.61±1.01) ×106,心肌细胞存活率分别为(74.17±6.27)％及(75.50±9.07)％,两者差异无显著性.分离的心肌细胞大部分不搏动,极少数细胞保持自律性收缩;Ⅱ型胶原在成年大鼠心肌组织中呈阴性表达,在剑突的软骨组织中呈阳性表达,Ⅲ型胶原在心肌组织中呈阳性表达;Western blotting检测显示,心肌组织中并无Ⅱ型胶原表达;SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳结果显示,Ⅱ型胶原酶试剂是一种包括5种蛋白的混合物.结论 成年大鼠心肌组织中无Ⅱ型胶原,用Ⅱ型胶原酶分离大鼠心肌细胞不具有针对性.
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比较不同消化方式获得的胎盘间充质干细胞
近年来,间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)已成为干细胞领域的研究热点,其不仅支持造血系统,还可在特定的培养条件下向多种组织细胞分化.人胎盘来源的MSC取材容易.该研究比较不同的组织消化酶(Ⅱ型胶原酶与Ⅳ型胶原酶)分离得到的间充质干细胞的特性.通过手术剪剥离胎盘表面羊膜,剪取胎儿侧的绒毛板组织机械破碎后,分别加含胶原酶Ⅱ和Ⅳ的PBS消化液消化,分离为单个核细胞,用含有10％胎牛血清的DMEM培养基在37℃、5％CO2、95％湿度下培养,48小时后全量换液,去除非贴壁细胞,添加新鲜培养基,当细胞融合90％左右时,胰酶消化传代.通过比较胶原酶Ⅱ和Ⅳ消化得到的原代细胞的总数,后续生长的图片记录,以及通过流式细胞测定使用不同消化酶从绒毛膜中分离得到间充质干细胞的表面标记CD90、CD73、CD105的阳性率情况,比较使用不同消化酶消化胎盘组织分离获得间充质干细胞,并将分离得到的胎盘间充质干细胞进行诱导分化成脂和成骨细胞,来鉴定其干细胞的生物学特性.结果发现消化时间相同,酶浓度相同的,以及摇床转速相同的情况下,使用Ⅱ型胶原酶可以得到更多的单个核细胞,细胞的生长情况较Ⅳ型胶原酶好,若从成本上来比较Ⅱ型胶原酶较Ⅳ胶原酶成本低,所以在生产和实验中可以优选Ⅱ型胶原酶.
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人脐带来源间充质干细胞分离培养方法的优化
背景:关于人脐带间充质干细胞的分离培养方法不一,如何提高人脐带来源间充质干细胞获得效率的问题尚未解决.目的:优选人脐带来源间充质干细胞制备的消化酶组分.方法:无菌条件下取正常足月剖腹产的脐带近胎儿段,按不同混合酶浓度比值划分为3组,混合酶Ⅰ组成分为0.4%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅱ组成分为0.1%Ⅱ型胶原酶、0.4%胰酶、0.02%EDTA和0.1%透明质酸酶;混合酶Ⅲ组成分为0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶.每组再按消化时间分为1,2,3 h 3个亚组.后重悬细胞终体积均定位4 mL并计数,采用含血清的DMEM培养液体外培养细胞.结果与结论:采用3种不同混合酶浓度进行消化,发现相同消化时间内,混合酶Ⅲ组消化细胞多(P<0.05).在作用3 h时,混合酶Ⅲ组获取的细胞中活细胞比值显著低于混合酶Ⅰ组和混合酶Ⅱ组(P<0.01).提示0.3%Ⅱ型胶原酶、0.1%胰酶、0.02%EDTA、0.1%透明质酸酶和0.1%DNA酶混合液消化脐带组织块2 h为获取脐带间充质干细胞的佳条件.
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兔骨膜细胞分离培养的方法改进
背景：近年来，骨膜作为细胞治疗的种子细胞来源，因其自身的优越性而备受关注。目的：探讨兔骨膜细胞分离培养的佳方法及其生物学特性。方法：无菌条件下取出兔胫骨内侧面骨膜，以Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法分离培养兔骨膜细胞，置于DMEM/F12完全培养基培养。倒置显微镜观察细胞形态；CCK-8法检测骨膜细胞增殖活性，绘制细胞生长曲线图；流式细胞仪检测细胞表型CD90、CD105；成骨诱导培养基诱导骨膜细胞成骨分化，2周后茜素红染色检测钙结节沉积；成脂诱导培养基诱导骨膜细胞成脂分化，2周后油红O染色检测脂滴颗粒。结果与结论：①Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法原代培养耗时短，提高了组织块成活率；Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法获得的骨膜细胞纯度较高，增殖能力强，呈梭形旋涡状或平形状生长，茜素红染色、油红 O 染色证实骨膜细胞具有多向分化潜能；②结果表明，Ⅱ型胶原酶消化结合组织块贴壁法能够在较短时间内获得高纯度的骨膜细胞，且增殖能力强，细胞具有多向分化能力。
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人胎盘不同组织分离间充质干细胞的生物学特性
背景：胎盘间充质干细胞来源稳定，正逐渐成为广受关注的再生医学种子细胞来源。
目的：比较从胎盘组织绒毛膜与绒毛滋养层分离获取人胎盘间充质干细胞生物学特性的差异。
方法：手术剪剥离人胎盘表面羊膜，分别剪取胎儿侧的绒毛膜与绒毛滋养层组织机械破碎后，分别加含Ⅱ型胶原酶的PBS消化液消化，分离为单个核细胞，用含有体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基在37℃、体积分数5%CO2、95%饱和湿度下培养，48 h后全量换液，去除非贴壁细胞，添加新鲜培养基，当细胞融合90%左右时，胰酶传代。通过观察原代细胞总数，细胞生长形态，以及间充质干细胞表面标记CD90、CD73、CD105的流式细胞测定结果比较从不同胎盘组织分离获得胎盘间充质干细胞的差异。
结果与结论：流式细胞仪测定结果显示，从绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞间充质干细胞表面标记CD90、CD73以及CD105的阳性率都在90%以上，两种来源的细胞生长都呈现典型的成纤维细胞形态，这表明绒毛膜与绒毛滋养层中分离得到细胞都具有间充质干细胞的特性。提示消化时间相同，酶浓度相同，以及摇床转速相同的情况下，可从绒毛膜中可以得到更多的细胞，对于后续培养更易获得较多的细胞。 -
骨性关节炎与骨质疏松症共病模型兔的建立及鉴定
背景:老年人群多同时患有骨性关节炎和骨质疏松症,但目前骨性关节炎与骨质疏松症两者之间的关系尚未明确.目的:构建骨性关节炎+骨质疏松症动物模型并进行鉴定.方法:贵阳医学院动物实验中心提供的37只2月龄雌性新西兰大白兔,30只随机分为骨性关节炎组、骨质疏松症组、骨性关节炎+骨质疏松症组,另设7只兔为正常对照组.分别制备骨质疏松症(造模方法:切除双侧卵巢+肌注甲泼尼龙)、骨性关节炎(造模方法:切除前交叉韧带)、骨性关节炎+骨质疏松症(造模方法:切除双侧卵巢+肌注甲泼尼龙+切除前交叉韧带)动物模型,确认造模成功后对上述3种模型软骨进行分离及培养,比较3者软骨细胞中Ⅱ型胶原酶分泌情况.结果与结论:①运用切除兔前交叉韧带、卵巢及肌注甲泼尼松龙琥珀酸钠的方法可使骨质疏松兔骨密度降低25％以上,从关节外观可见明显关节软骨剥脱,膝关节X射线检查可见明显骨赘生成,MRI检测可显示明显关节软骨损伤,由此可知通过上述方法可成功制备骨质疏松症合并骨性关节炎的模型;②骨性关节炎组、骨质疏松症组、骨性关节炎+骨质疏松症3组兔膝关节软骨中均能成功提取出软骨细胞,与骨质疏松症组比较骨性关节炎+骨质疏松组软骨细胞Ⅱ型胶原酶的能力下降差异明显(P<0.05);③结果说明:实验成功建立了骨性关节炎+骨质疏松症动物模型.
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Ⅱ型胶原酶消化法培养兔关节软骨细胞
背景：目前关节软骨细胞的分离培养技术已经比较成熟，但是研究中发现通过目前技术培养的软骨细胞生长周期慢，容易出现退变现象，不利于后续试验的进行。
目的：改进并探讨4周龄新西兰大白兔膝关节软骨细胞的分离与培养的方法。
方法：无菌条件下取4周龄新西兰大白兔双侧膝关节软骨，采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法，分离关节软骨细胞并进行原代、传代培养；采用形态学观察，甲苯胺蓝染色以及Ⅱ型胶原免疫组织化学方法对关节软骨细胞进行鉴定；MTT法检测关节软骨细胞增殖情况。
结果与结论：倒置显微镜下见膝关节软骨分离的原代软骨细胞6 h后开始贴壁，72 h可形成单层，96 h即可传代；前3代软骨细胞表型稳定，增殖力良好；第4，5代软骨细胞增殖能力减弱，绝大部分细胞变为长梭形和不规则形状。甲苯胺蓝染色显示培养的软骨细胞细胞质染成浅蓝色，细胞核染成深蓝色；免疫组织化学显示软骨细胞Ⅱ型胶原呈黄褐色阳性表达；MTT法检测表明前3代软骨细胞增殖差异无显著性意义(P>0.05)，且第1-3代与4代软骨细胞在培养第4-7天时，吸光度值差异有显著性意义(P<0.05)，与第5代软骨细胞在培养1-7天时，吸光度值差异有显著性意义(P<0.05)。提示采用Ⅱ型胶原酶消化并机械吹打的方法能够获得大量生长速度快且不宜退变的新西兰大白兔膝关节软骨细胞，且培养的前3代新西兰兔膝关节软骨细胞为适宜。 -
一种简易的人原代肝细胞分离培养方法
背景:采用原位两步灌流法分离肝细胞数量多,活性高,但灌流装置价格昂贵,操作环节多,技术要求高,所需时间长,易污染,限制了在一般实验室及人原代肝细胞在医学中的应用.目的:建立人原代肝细胞体外分离培养方法.方法:采用多点穿刺灌注方法将预温38 ℃的前灌流液及Ⅱ型胶原酶溶液灌依次灌入人肝脏组织中,经消化及离心后获得人原代肝细胞;倒置显微镜和电镜观察细胞形态特征,并鉴定.结果与结论:经多点穿刺灌注法消化分离后可获得约5×105个肝细胞,分离获得的肝细胞活率达90%;细胞培养24 h后呈铺路石样生长;电镜示肝细胞呈典型形态特征:细胞核大,胞质少;培养的肝细胞 PAS糖原染色阳性,白蛋白表达阳性.说明多点穿刺灌注法分离人原代肝细胞简单易行,肝细胞产量高、活力好、纯度高,分离培养的肝细胞具有特异性生物学功能表达,适宜在一般条件实验室推广应用.
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前牙全瓷冠不同肩台设计对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响
目的 探讨两种全瓷冠肩台设计形态对修复前、后龈沟液中Ⅱ型胶原酶(COL-Ⅱ)水平的影响.方法 将要求上颌中切牙全瓷冠修复的就诊患者随机分为90度肩台组和凹形肩台组,每组20颗患牙.应用ELISA法测定修复前,修复粘固后1个月、3个月、6个月、12个月的龈沟液样本COL-Ⅱ水平,进行统计学处理.结果 全瓷冠修复粘固后3个月,90°肩台组龈沟液COL-Ⅱ水平明显高于凹形肩台组,经t检验差别有统计学意义(P＜0.05).90度肩台组和凹形肩台组修复粘固后1个月和3个月与修复前、修复粘固后6个月、12个月均有差异(P＜0.01).90度肩台组和凹形肩台组修复粘固后6个月、12个月与修复前COL-Ⅱ水平无显著差异(P＞0.05).结论 全瓷冠建议采用凹形肩台预备,牙周组织在全瓷冠修复后6个月可以恢复到修复前水平.
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可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白的理化特性研究
目的 研究可溶性鸡Ⅱ型胶原蛋白(SCCⅡ)的物理化学特性.方法 用光谱法测定吸收峰和等电点,HPLC法检测氨基酸组成,乌氏黏度计测定不同条件下溶液的增比黏度.用SDS-PAGE测定相对分子量(Mr),结合免疫印迹法分析胃蛋白酶、胰蛋白酶、α-糜蛋白酶和Ⅱ型胶原酶作用于SCCⅡ和热变性后的SCCⅡ(D-SCCⅡ)的酶解产物.结果 SDS-PAGE显示SCCⅡ亚基的Mr约为120 ×103,能与抗SCCⅡ抗体反应;D-SCCⅡ含有10多条免疫印迹呈阳性反应的片段.SCCⅡ溶液的大吸收峰为230 nm,等电点pH约6.25.氨基酸组成中,GlY、Pro、Glu和Ala含量高,芳香族氨基酸低.SCCⅡ溶液的增比黏度随浓度的增加而增加,在25～45℃范围内随着温度的升高逐渐下降.在胃蛋白酶和糜蛋白酶作用下SCCⅡ的电泳和免疫印迹图谱无变化,Ⅱ型胶原酶可使SCCⅡ快速水解,胰蛋白酶作用后出现10条免疫印迹阳性条带;D-SCCⅡ经酶解后免疫印迹无阳性条带.结论 SCCⅡ具有独特的物理化学性质,对消化酶有一定抵抗作用,胰蛋白酶作用后可出现多条活性片段.
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Ⅱ型胶原酶构建在体角膜扩张动物模型的可行性研究
背景 圆锥角膜以角膜中央或旁中央进行性变薄膨出、高度散光或角膜瘢痕为临床特征,其发病机制和防治是研究热点,但目前尚无公认的圆锥角膜动物模型建立方法.圆锥角膜的解剖病理基础是角膜扩张,探讨角膜扩张的圆锥角膜动物模型的建立方法有助于对圆锥角膜的角膜生物力学变化进行研究.目的 应用可视化角膜生物力学分析仪(Corvis ST)检测Ⅱ型胶原酶处理后角膜的生物力学性能,探讨利用Ⅱ型胶原酶构建在体角膜扩张模型的可行性.方法选取健康新西兰白兔10只,刮除兔眼角膜上皮后,将直径为8 mm的角膜环钻置于右眼角膜中央,滴入5 mg/mlⅡ型胶原酶(含质量分数15％右旋糖酐的PBS配制)溶液,浸泡角膜30 min制备角膜扩张模型,左眼以同样方法用含15％右旋糖酐的PBS浸泡角膜30 min作为对照.于造模前及造模后14d,采用手持电子角膜曲率计和手持角膜超声测厚仪分别测定角膜平均曲率(Km)及中央角膜厚度(CCT),造模后14 d采用Corvis ST行在体角膜生物力学参数测定,过量麻醉法处死实验兔并收集角膜组织行组织病理学及透射电子显微镜检查. 结果 造模前,模型组和对照组兔Km值分别为(48.28±2.29)D和(48.82±1.63)D,CCT分别为(356.50±19.13) μm和(356.20±21.66)μm,差异均无统计学意义(均P＞0.05).造模后14d,模型组兔眼Km增加至(48.87±2.27)D,CCT减少至(340.40±19.84) μm,与对照组的(46.86±1.47)D和(367.80±23.38) μm比较,差异均有统计学意义(均P＜0.01).造模后14 d,模型组兔角膜大压陷深度平均值为(1.25±0.07) mm,明显大于对照组的(1.15±0.13)mm,差异有统计学意义(t=2.65,P＜0.05),2个组间第1/第2压平时间、第1/第2压平角膜长度、第1/第2压平速度、大压陷曲率半径和大压陷时两屈膝峰间距的差异均无统计学意义(均P＞0.05).角膜组织形态学和超微结构检查显示,与对照组比较,模型组兔角膜基质胶原纤维排列疏松、紊乱,纤维间隙增大.结论 Ⅱ型胶原酶能降低角膜生物力学特性,可考虑用于建立动物角膜扩张模型.
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兔软骨细胞的分离及其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养实验研究
目的：探讨体外分离兔软骨细胞的方法并观察其与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养时的生物活性。方法取4周龄的新西兰大耳兔，处死后在无菌条件下取关节软骨。通过胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶消化软骨细胞。倒置相差显微镜下观察软骨细胞特点，制作细胞爬片行甲苯胺蓝染色。将第3代兔软骨细胞与Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜共培养，噻唑蓝（MTT）法和糖胺聚糖含量测定法检测软骨细胞在胶原膜上的细胞活性，扫描电镜观察软骨细胞在复合胶原膜上的生长情况。结果分离出的原代软骨细胞初为卵圆形，贴壁后变成三角形或多边形，可被甲苯胺蓝染色。软骨细胞在Ⅰ/Ⅱ型复合胶原膜上生长良好。结论两部酶法可获得大量软骨细胞，MTT法和扫描电镜证实软骨细胞可在复合胶原膜上正常扩增。
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替硝唑冲洗液对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响
目的:探讨龈下刮治同期使用药物冲洗对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响.方法:选取100例慢性牙周炎患者,随机分为2组,每组50例.试验组行超声龈下刮治同期0.2%替硝唑冲洗,对照组行单纯超声龈下刮治纯净水冲洗.分别于治疗前及治疗后2周收集患牙的龈沟液并记录相关的临床指标.采用双抗体夹心酶联免疫法检测龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平.结果: 2组患者治疗后患牙牙周临床指标均有明显的改善,治疗后龈沟液中Ⅱ型胶原酶的水平明显降低,差异有统计学意义(P<0.01),且试验组较对照组下降幅度更明显,差异有统计学意义(P<0.05).结论:超声龈下刮治同期0.2%替硝唑冲洗较单纯超声龈下刮治使龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平降低更显著.
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Ⅱ型胶原酶在软骨链蛋白纯化、分离中的效果观察
目的 探讨在软骨链蛋白(CLP)的分离、纯化实验中,采用Ⅱ型胶原酶(C Ⅱ)消化胶原蛋白,提高CLP的回收率. 方法 ①Sepharose 4B的活化与AH连接;②HA与AH-Sepharose 4B连接;③按1:2:3的C Ⅱ比例浓度消化胶原蛋白;④亲和层析. 结果 亲和层析淋洗前后各样品的吸光度(A)分别为S0:S1:S2:S3=0.44:0.39:0.35:0.31和S0:S1:S2:S3=0.72:0.84:0.92:0.99;亲和层析淋洗曲线峰的高度(H)mAu值:S0＜S1＜S2＜S3,淋洗曲线峰出现的时间(T):S0＞S1＞S2＞S3. 结论 C Ⅱ有助于改善CLP粗提取液的粘度,提高CLP的回收率.
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两种软骨终板细胞体外培养方法效果的比较研究
目的 比较原代椎间盘软骨终板细胞实验室培养中Ⅰ型与Ⅱ型胶原酶消化效率的差异.方法 提取新西兰大白兔椎间盘软骨终板组织,将其剪碎并随机分成2等份,标记为Ⅰ型胶原组和Ⅱ胶原型组;用0.25％的胰蛋白酶预消化后,分别用0.02％Ⅰ型胶原酶和0.02％Ⅱ型胶原酶在37 cc消化3次,每次lh;将3次消化所得的细胞悬液混匀后离心,获取细胞并进行培养与传代;对两组软骨终板细胞分别进行细胞计数、细胞形态学观察和细胞增殖情况检测等处理,比较两组软骨终板细胞数目、形态及增殖情况的差异.结果 1)细胞计数:Ⅰ型胶原组细胞3次细胞计数结果分别为5.75×104个/mL、5.50×104个/mL、6.25×104个/mL,获得软骨终板数目(5.83±0.31)×104个/mL;Ⅱ胶原型组细胞3次细胞计数结果分别为8.75×104个/mL、9.50×104个/mL、8.25×104个/mL,获得软骨终板数目(8.83±0.51)×104个/mL,Ⅰ型胶原组细胞总量明显少于Ⅱ胶原型组;2)细胞形态:两组软骨终板细胞多呈多角形,胞核大而圆,形态无明显差异.3)细胞增殖:Ⅰ型胶原组细胞MTT读数OD值为(0.561±0.003),Ⅱ胶原型组细胞MTT读数OD值为(0.562±0.002),组间差异无统计学意义(P＞0.05).结论 Ⅱ型胶原酶较Ⅰ型胶原酶更适用于原代椎间盘软骨终板细胞的分离培养.
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三种不同乳鼠原代心肌细胞消化分离方法的对比研究
目的 对比研究三种乳鼠原代心肌细胞消化分离方法,比较不同方法分离获取的心肌细胞在数量、纯度、活力上的差异,为相关实验研究提供选择.方法 按照不同的消化方法进行分组,A组为0.08％胰蛋白酶单纯消化组;B组为0.08％胰蛋白酶+0.08％Ⅱ型胶原酶混合消化组;C组为0.08％胰蛋白酶和0.08％Ⅱ型胶原酶分离消化组.记录差速贴壁后的细胞数和活细胞率,对贴壁24 h后的心肌细胞进行免疫荧光染色,计算心肌细胞纯度,通过激光共聚焦显微镜对JC-1染色的心肌细胞进行线粒体膜电位检测,比较红绿荧光密度的差异,通过能量代谢间接反映细胞活力.结果 三种方法分离获得的心肌细胞数差异无统计学意义(P＞0.05),而活细胞率C组高于A组(P＜0.01);三组分离获得的心肌细胞纯度差异无统计学意义(P＞0.05);线粒体膜电位,A组荧光比值为0.928±0.078,B组荧光比值为0.943±0.099,C组荧光比值为1.160±0.089,三组之间差异有统计学意义(P＜0.01),C组线粒体膜电位高于A组和B组(P＜0.01).结论 三种消化方法在细胞数和细胞纯度上无明显差异,0.08％胰蛋白酶和0.08％Ⅱ型胶原酶分离消化的心肌细胞在活细胞率和细胞活力方面更优,可以作为常规的乳鼠心肌细胞分离方法的选择.
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一种椎间盘组织总RNA提取的改良方法
目的 改进传统常规法在椎间盘组织中总RNA提取,获得高质量的椎间盘组织总RNA.方法 健康成年Newsland白兔,完整取出椎间盘组织,随机分RNA传统方法组和酶消化改良组.传统组,按Trizol法提取总RNA;酶消化改良组,加入0.2%Ⅱ型胶原酶,置于细胞培养葙消化数小时,加入含小牛血清的PBS液终止,离心收集细胞.余步骤同传统组.结果 传统组,电泳结果未见28S和18S条带,5S条带部分可见;A260/280比值在1.5左右,蛋白多糖污染重.而酶消化组,电泳结果可见清晰的28S、18S和5S条带,且28S条带的亮度约是18S的两倍;3.260/280比值在1.8～2,0之间,无蛋白污染,此法提取的RNA,逆转录后可用于扩增β-actin基因.结论 酶消化改良法可望成为椎间盘组织总RNA提取的好方法.RNA片断完整,纯度高,无蛋白污染,不影响后续基因表达(RT-PCR)的分析,并且重复性好,可以推广.
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消化时间对兔纤维环细胞生物学特性影响的实验研究
目的 探索兔纤维环细胞分离培养的佳消化时间及不同消化时间对细胞生物特性的影响.方法 将20只新西兰大白兔随机均分为A、B、C、D、E组,空气栓死并取其纤维环组织,采用胰蛋白酶和Ⅱ型胶原酶序贯消化法分离纤维环细胞,A、B、C、D、E组Ⅱ型胶原酶消化的时间分别为1、2、3、4、5h,获取的细胞用DMEM培养基进行培养.通过比较各组获取的原代细胞数量、细胞存活率,以及第3代细胞在形态、细胞外基质表达情况等方面的差异.结果 随着消化时间的增加,获取的原代细胞数目越多,C、D、E组均可获得较理想的细胞数量,但E组细胞出现贴壁不良.5组第3代细胞甲苯胺蓝异染性、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原免疫染色均呈阳性,但C、D组较其他三组着色更深.结论 用序贯消化法分离培养兔纤维环细胞,Ⅱ型胶原酶的佳消化时间为3～4 h.
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三种不同龈下冲洗液对慢性牙周炎龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响
目的:比较在龈下刮治的同时使用不同的药物冲洗对慢性牙周炎患者龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平的影响.方法:选取90例慢性牙周炎患者,随机分为3组,在超声龈下刮治同时分别使用0.2%氯已定溶液、0.2%替硝唑溶液和生理盐水进行冲洗.收集治疗前及治疗2周后患牙的龈沟液并记录相关的临床指标.采用双抗体夹心ELISA法对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平进行检测.结果:经过超声龈下刮治,惠牙牙周临床指标均有明显的改善,龈沟液中Ⅱ型胶原酶的水平明显降低,0.2%氯已定组和0.2%替硝唑组降低较生理盐水组更显著(P<0.01),但前两组之间无显著性差异(P>0.05).结论:超声龈下刮治的同时使用抗菌药物冲洗会对龈沟液中Ⅱ型胶原酶水平产生显著影响.
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酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞
目的 采用胶原酶预消化组织块贴壁法培养人退变椎间盘髓核细胞,与单纯Ⅱ型胶原酶消化法比较培养效果.方法 收集腰椎间盘退变患者的髓核组织分为A、B两组进行培养.A组:体积分数0.025％Ⅱ型胶原酶预消化30 min后组织块接种;B组:体积分数0.025％Ⅱ型胶原酶消化5h后过滤、离心、接种培养.比较两种方法培养成功率和原代细胞融合时间.HE、甲苯胺蓝、免疫细胞荧光染色法观察细胞形态及Sox-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖的表达.结果 A、B两组培养成功率差异无统计学意义(P＞0.05),融合时间A组显著短于B组(P＜0.01).A组培养的髓核细胞可被甲苯胺蓝染成天蓝色,免疫细胞荧光检测Sox-9、Ⅱ型胶原、蛋白聚糖呈阳性表达.结论 与单纯Ⅱ形胶原酶消化法比较,Ⅱ型胶原酶预消化后贴壁培养法培养人退变椎间盘髓核细胞成功率高,短时间内可获大量细胞,且强表达Sox-9、Ⅱ型胶原和蛋白聚糖.
