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K-ras和IGF-IR反义寡核苷酸联合转染对人胰腺癌Patu8988细胞增殖和凋亡的影响
背景与目的:已有研究表明K-ras基因点突变及胰岛素样生长因子I受体(insulin-like growth factor receptor type 1, IGF-IR)过表达在胰腺癌的发生发展过程中起着重要作用,针对K-ras mRNA和IGF-IR mRNA的反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide, ASODN)均可抑制胰腺癌细胞的增殖.本研究旨在探讨针对K-ras基因12密码子点突变的硫代反义寡核苷酸(K-ras ASODN)联合IGF-IR硫代反义寡核苷酸(IGF-IR ASODN)对人胰腺癌Patu8988细胞体内外增殖和凋亡的影响.方法:顺序特异引物聚合酶链反应(polymerase chain reaction using special sequence primers. PCR-SSP)法和基因测序检测Patu8988细胞K-ras点突变形式,根据点突变形式设计并合成K-ras ASODN.K-ras ASODN和IGF-IR ASODN分别单独和联合作用Patu8988细胞后,通过四甲基偶氮唑蓝(MTT)法、克隆形成实验及透射电镜观察其对Patu8988细胞增殖及形态结构的影响;流式细胞术(FCM)检测K-ras和IGF-IR蛋白表达和细胞凋亡;RT-PCR检测K-ras和IGF-IR mRNA表达水平;以Patu8988细胞建立裸鼠人胰腺癌模型,观察K-ras ASODN与IGF-IR ASODN联合应用在体内的抗肿瘤效果.结果:PCR-SSP法和基因测序检测表明Patu8988细胞存在K-ras基因第12密码子点突变,其突变方式为GGT→GTT.2～32 mg/L的K-ras ASODN和2～32 mg/L的IGF-IR ASODN单独应用均能一定程度抑制Patu8988细胞增殖、诱导细胞凋亡,两者联合应用较单独应用抑制作用更为显著(P<0.01).体内实验表明,K-ras ASODN与IGF-IR ASODN联合应用较单独应用能更有效地抑制BALB/c裸鼠胰腺癌的生长(P<0.01).结论:K-ras ASODN和IGF-IF ASODN两种反义寡核苷酸对人胰腺癌Patu8988细胞增殖的抑制具有协同作用,其机制可能是联合下调K-ras、IGF-IR蛋白及K-ras、IGF-IR mRNA表达水平.
关键词： 胰腺肿瘤 反义寡核苷酸 K-RAS 胰岛素样生长因子I受体 Patu8988细胞 -
胸水细胞8-OH-dG、k-ras和p53基因的表达及其临床意义
背景与目的:DNA的氧化损伤是外来致癌物导致癌变发生的重要机制之一.8-羟基脱氧鸟嘌呤(8-hydoxy-2deoxyguanosine,8-OH-dG)作为DNA氧化损伤的指标,在肺癌的发生、发展及预后扮演着重要角色.研究发现肺组织癌变的过程中8-OH-dG表达水平与k-ras、p53基因突变的关系密切,故作为肺癌标记物在良、恶性判别诊断中具有重要意义.本课题拟探讨胸水细胞8-OH-dG、k-ras和p53基因表达与肺癌的关系,并分析它们在肺癌的微创性良、恶性判别诊断中的价值.方法:用免疫细胞化学法测定53例肺癌患者、53例非肺癌患者的胸水细胞中8-OH-dG、k-ras和p53基因的蛋白表达情况.结果:肺癌组、非肺癌组胸水细胞8-OH-dG阳性率分别为75.5%(40/53)与15.1%(8/53),k-ras基因的蛋白表达阳性率分别为64.2%(34)与3.8%(2),p53基因的蛋白表达阳性率分别为69.8%(37/53)与18.9%(10/53),P值均＜0.01,两组比较差异有高度显著性;53例肺癌患者胸水细胞8-OH-dG、k-ras和p53基因的蛋白表达分值均数分别为1.68±1.21、1.32±1.06与1.57±1.15,经等级相关分析8-OH-dG与k-ras基因的蛋白表达呈高度正相关(Rs=0.643,P＜0.01),8-OH-dG和p53基因的蛋白表达呈高度正相关(Rs=0.827,P＜0.01),k-ras和p53基因的蛋白表达呈高度正相关(Rs=0.897,P＜0.01).结论:肺癌组胸水细胞8-OH-dG、k-ras和p53基因之间的蛋白表达有关联.肺癌患者胸水细胞8-OH-dG、k-ras和p53基因的蛋白表达阳性率和分值高于非肺癌患者,可作为诊断和筛检高危人群的参考指标之一.
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血清 K-ras基因突变检测联合 CA19-9测定在胰腺癌诊断中的应用
背景与目的:胰腺癌早期诊断困难,常用的肿瘤标记物如 CA19-9,虽敏感度较高但特异性较差,胰腺癌中常有 K-ras基因的突变,而且特异性较高,我们通过检测血清 DNA中 K-ras基因的突变以及测定血清 CA19-9的含量,以探讨两者联合检测在胰腺癌诊断中的临床意义.方法:取 39例胰腺癌患者的血清,抽提 DNA,采用突变富集聚合酶链反应限制性片段长度多态性法检测 K-ras基因第 12密码子突变 , 同时应用放免法测定血清 CA19-9的含量,并与 17例其他胰腺疾病患者和 21例健康者的血清检测结果作对照,分析两者联合应用的临床诊断价值. 结果:在 28例胰腺癌和 2例其它胰腺疾病患者血清中检测到 K-ras基因突变,阳性率分别为 71.79% 和 11.76%;而血清 CA19-9测定的阳性率则分别为 71.79%和 41.18%.平行法联合检测 K-ras和 CA19-9诊断胰腺癌时敏感性增至 94.87%,系列法联合检测时特异性增至 94.12%. 21例健康对照者血清中 K-ras基因与 CA19-9均无异常.结论:联合血清 K-ras基因突变检测与 CA19-9测定可提高胰腺癌诊断的特异性和敏感性,具有一定的临床应用价值.
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粪、血APC及K-ras基因突变联合检测在大肠癌筛查中的作用
目的 通过联合检测粪、血浆中APC和K-ras两种基因的突变,探讨其在大肠癌筛查中的作用.方法 收集本院2003年10月～2004年3月行肠镜检查患者的肝素抗凝血5 ml,大便3～5 g.提取粪便及血浆DNA,采用PCR-SSCP法检测APC和K-ras突变.结果 和结论(1)大肠癌和腺瘤患者血浆APC基因突变分别为41.9%和57.7%(P＞0.05),高于正常对照组(P＜0.05).粪便APC基因突变分别为51.6%和42.3%(P＞0.05),高于正常对照组(P＜0.05).两种检测方法具有高度的吻合度(kappa值为0.811,P＜0.001).(2)血浆K-ras基因突变在大肠癌、腺瘤和正常对照分别为48.4%、3.8%和0%,粪便K-ras基因突变在3组中分别为54.8%、7.7%和11.1%,大肠癌组高于腺瘤组和正常组(P＜0.05),腺瘤组和正常组间无差异(P＞0.05).两种方法检测的吻合度一般(kappa值为0.662,P=0.000).(3)联合检测APC及K-ras基因突变可以提高诊断大肠癌的灵敏度.血、粪联合检测检测APC和K-ras基因突变较粪便检测无明显优势.(4)APC基因突变与是否发生肿瘤区域淋巴结转移有关,K-ras基因突变与病变分化程度有关.
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苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌细胞株增殖的抑制作用及机制研究
【目的】观察苦参碱对K-ras基因突变型结肠癌SW480细胞增殖的抑制作用及机制。【方法】以不同浓度苦参碱干预K-ras基因突变型人结肠癌SW480细胞，采用新型四唑氮盐（MTS）做比色分析测定细胞增殖，流式细胞技术（FCM）检测细胞凋亡，细胞划痕法观察细胞侵袭转移能力的变化， Western blotting方法检测细胞内丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路下游关键激酶MEK1/2蛋白的表达。【结果】与空白对照组比较，0.125~1 mg/mL浓度的苦参碱能显著抑制SW480细胞增殖，促进细胞凋亡，有效抑制结肠癌细胞的移行，降低MEK1/2蛋白的表达（P＜0.05），其作用强度随药物浓度增加有升高的趋势。【结论】苦参碱可能通过下调MAPK信号通路下游MEK1/2蛋白的表达，有效抑制SW480细胞的增殖和移行，并促进其凋亡。
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K-ras基因突变预测Ⅲ期结直肠癌术后辅助化疗的预后
目的 探讨K-ras基因突变能否预测结直肠癌术后辅助化疗的预后.方法 采用回顾性队列研究方法收集和分析临床病理资料,HRM法测定Ⅲ期结直肠癌K-ras基因突变,Kaplan-Meier和Cox比例风险模型评估K-ras基因突变对预后的影响.结果 Ⅲ期结直肠癌K-ras基因突变发生率为28.9%,K-ras基因野生型与突变型的5年无瘤生存率(DFS)和总生存率(OS)分别为53%和51%(P=0.38)、56%和58%(P=0.56).无论是单因素分析还是多因素分析均显示K-ras基因状态对Ⅲ期结直肠癌术后辅助化疗的DFS和OS均无明显影响(P＞0.05).结论 K-ras基因突变状态与Ⅲ期结直肠癌术后辅助化疗的预后无明显相关性.
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k-ras蛋白和环氧合酶-2在结直肠癌中的表达及意义
目的 探讨结直肠癌组织中 k-ras蛋白、环氧合酶-2(cox-2)的表达及临床意义.方法 采用免疫组织化学法检测60例结直肠癌组织、30例结直肠腺瘤组织和30例癌旁正常组织中 k-ras蛋白和cox-2的表达.结果 k-ras蛋白在结直肠癌组织和结直肠腺瘤组织中的阳性表达率高于癌旁正常组织(P<0.01),其表达与组织分化程度有关,与性别、年龄、淋巴结转移、Dukes分期、肿瘤部位无关.cox-2在结直肠腺癌组织中的表达显著高于结直肠腺瘤组织和癌旁正常组织(P<0.05),cox-2的表达与组织分化程度、淋巴结转移、Dukes分期有关,与性别、年龄、肿瘤部位无关.k-ras蛋白和cox-2之间的表达呈正相关(r=0.429).结论 k-ras蛋白和cox-2与结直肠癌的发生、发展有关.
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EGFR、Cyclin D1、K-RAS与喉癌的关系研究进展
喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤,近年来喉癌的发病率有着明显上升的趋势.喉癌约占头颈肿瘤的13.9%,占全身恶性肿瘤的5.7%;目前喉癌的病因仍不十分明了,可能与吸烟、饮酒、环境污染、病毒感染等因素有关.随着基因研究的不断深入,人们认识到喉癌的发生是一个多因素参与的复杂过程,其中抑癌基因失活和癌基因活化是肿瘤发生的重要原因,本文就近年来研究较深入的与喉癌密切相关的几个热点基因作一综述.
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miR-622抑制肺癌细胞的生长
目的 探讨miR-622对H460肺癌细胞增殖的影响及其作用机制.方法 利用脂质体瞬时转染方法将miR-622模拟物及其对照核苷酸转染至肺癌细胞内.miRNA定量试剂盒检测miR-622的表达.CCK-8试剂盒检测细胞增殖.生物信息学分析miR-622的靶点.蛋白印迹方法检测K-Ras蛋白的表达.构建含K-Ras mRNA的3非翻译区的报告基因载体,检测萤火虫/Renilla荧光素酶活性.结果 转染miR-622模拟物可提高miR-622的表达,并使H460和16HBE-T的细胞增殖率分别降至(58.60±4.27)％和(65.17±4.67)％,P均＜0.01.生物信息学分析K-Ras为miR-622的一潜在靶点.转染miR-622模拟物可明显抑制K-Ras蛋白的表达.共转染miR-622模拟物和K-Ras-3'UTR报告基因,可使萤火虫/Renilla荧光素酶的活性降低至(60.22±2.50)％.结论 miR-622可通过负性调控靶点K-Ras抑制肺癌细胞的增殖.
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联合检测K-ras、P53基因突变及CEA mRNA表达对大肠癌肝转移的预测价值
目的:通过对大肠癌患者手术后门静脉血K-ras、P53基因突变及CEA mRNA表达进行分析,探讨联合检测K-ras、P53基因突变及CEA mRNA表达对大肠癌肝转移的预测价值.方法:大肠癌患者45例,取手术后门静脉血标本,用PCR-SSCP方法分别进行K-ras和P53基因突变分析,用RT-PCR方法检测CEA mRNA表达情况,统计联合检测K-ras、P53基因突变及CEA mRNA表达预测大肠癌肝转移的敏感性、特异性、准确性、阳性预测值、阴性预测值、阳性似然比及阴性似然比.结果:手术后门静脉血K-ras、P53突变阳性率分别为46.7%(21/45)和48.9%(22/45).手术后门静脉血CEA mRNA表达阳性率为60%(27/45).45例大肠癌患者随访2年后,肝转移14例,其中K-ras、P53基因突变及CEA mRNA表达共阳性6例,共阴性1例,部分阳性7例.统计结果显示大肠癌肝转移率:共阳性组>部分阳性组>共阴性组(x2=7.30,P=0.007).联合检测(当其中一个指标为阳性时,诊断肝转移)敏感性92.9%(13/14);特异性38.7%(12/31);准确性55.6%(25/45);阳性预测值40.6%(13/32);阴性预测值92.3%(12/13),阳性似然比=12.1,阴性似然比=0.08.结论:结肠癌术后门静脉血K-ras基因和P53基因突变及CEA mRNA 表达均有较高的阳性率,联合检测对大肠癌肝转移有理想的预测价值.
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高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便基因突变与临床病理参数的关系
目的 初步探讨高分辨率熔解曲线分析检测大肠癌患者粪便DNA突变与临床病理参数的关系.方法 收集2009年3月～2009年9月在本院住院的39例大肠癌患者的新鲜粪便标本约1 g,应用HRM法检测粪便中APC、K-ras、P53基因的突变情况,并对结果进行统计学分析.结果 大肠癌患者粪便中APC、K-ras、P53基因的突变与大肠癌患者性别、年龄、分化状态、病变部位、Dukes分期和有无淋巴结转移无关.结论 未发现粪便APC、K-ras和P53基因突变情况与大肠癌患者的临床病理参数具有相关性.
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K-ras基因在结直肠癌中的表达及与病理的关系
目的 检测结直肠癌中K-ras基因突变情况,探讨其与结直肠癌患者病理资料的关系,为患者的靶向治疗提供基础.方法 检测长海医院收治的200例结直肠癌患者K-ras基因突变情况,结合其病理资料进行统计分析.结果 K-ras基因突变者56例(28%),K-ras基因突变与肿瘤的淋巴结转移、肝转移及TNM分期关系密切(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤浸润深度及肿瘤分化程度等无明显相关性(P>0.05).结论 K-ras基因突变的检测有助于筛选对抗表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)靶向治疗药物有效的结直肠癌患者.
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散发性结直肠癌APC、K-ras、p53、MMR基因突变检测
目的 探讨结直肠癌中APC、K-ras、p53、MMR基因突变模式.方法 应用酚/氯仿法提取48例结直肠癌组织及其相应正常黏膜组织的DNA,用聚合酶链反应(PCR)、单链构象多态性分析(SSCP)和DNA测序等方法检测APC基因第l5外显子突变密集区(mutation cluster region,MCR)区段、K-ras 、p53和MMR基因的突变.结果 hMLH1未发生突变, APC、K-ras、p53基因和hMSH2的突变率分别为37.5 %(18/48)、43.8 %(21/48)、35.4% (17/48)和4.2%(2/48).APC、K-ras、p53或hMSH2基因突变率高达91.7% (44/48).APC、K-ras,p53基因均发生突变的发生率为4.2%(2/48).结论 结直肠癌的发生、发展并不完全遵循由正常结直肠黏膜上皮细胞向腺瘤和侵袭性癌转化的过程,可能存在其他结直肠癌发病机制.
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FORFIRI联合西妥昔单抗治疗K-ras 13突变型结肠癌肝转移1例
结直肠癌的发病率呈逐年上升、年轻化的趋势。早期患者可获得根治性手术，而约50%的患者就诊时由于局部晚期或远处转移已失去手术治疗的机会，联合化疗是提高疗效、改善患者生存质量的有效治疗手段。FORFIRI方案（CPT-11+5-FU+CF）化疗是治疗晚期结肠癌的标准方案之一，但由于肿瘤耐药性及化疗相关的严重不良反应常常导致治疗失败［1］。西妥昔单抗（Cetux-imab，C225）是一种IgG1型单克隆抗体，现已成功应用于头颈部肿瘤及结直肠癌的治疗中［2］。研究证实C225联合标准一线化疗方案用于K-ras野生型的转移性结肠癌患者，可显著提高总生存期［3，4］。我科采用C225+FORFIRI方案治疗K-ras13突变型的晚期结肠癌肝转移1例，取得良好疗效。现报道如下。
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癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用
目的:探讨癌基因c-myc和K-ras在卵巢癌发生发展中的作用.方法:用Moloney逆转录病毒载体先后将正常的c-myc基因和突变的K-ras基因转导入小鼠正常卵巢上皮细胞(MOSE),建立表达c-myc或(和)K-ras基因的细胞系,分别称为Myc细胞、Ras细胞、RM细胞,通过细胞增殖试验、裸鼠体内成瘤试验研究转基因后MOSE细胞生物学特性的改变.结果:用携带有c-myc和K-ras基因的重组逆转录病毒感染MOSE后,用RT-PCR和Western blot能分别检测到有相应的c-myc或(和)K-ras mRNA转录以及蛋白的表达;Ras细胞增殖显著快于MOSE和Myc细胞(P＜0.01),RM细胞显著快于Myc细胞(P＜0.05);将Ras和RM细胞腹腔注射于裸鼠体内,有肿瘤形成,免疫组化结果显示瘤组织有K-ras和c-myc蛋白的表达;MOSE细胞和Myc细胞没有肿瘤形成.结论:重组逆转录病毒载体具有高转导效率,突变的K-ras可使MOSE发生恶性转化,在体内形成肿瘤;c-myc不能使MOSE发生恶性转化,但具有协同作用.
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结直肠癌组织K-ras、BRAF及PIK3CA基因突变的检测及其与临床病理特征的关系
目的:探讨结直肠癌组织K-ras、BRAF及PIK3CA基因突变的检测及其与临床病理特征的关系.方法:选取150例结直肠癌患者,收集结直肠癌患者肿瘤组织标本,提取DNA进行PCR扩增,观察结直肠癌患者K-ras、BRAF及PIK3CA基因的突变率,并分析其与患者年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期等临床病理特征之间的关系.结果:150例结直肠癌患者中,检测到K-ras基因突变率为32％(48/150);BRAF基因突变率为8％(12/150);PIK3CA基因突变率为12％(18/150);3种目的基因与患者TNM分期的关系,发现BRAF基因突变与患者TNM分期无明显关系(P＞0.05),而K-ras与PIK3CA基因突变与患者TNM分期存在明显关系(P＜0.05),随着患者TNM分期的提高,患者基因突变的情况明显增多;3种目的基因与患者的性别、年龄、肿瘤位置等病理学指标无明显关系(P＞0.05).结论:对K-ras、BRAF及PIK3CA基因进行分析,K-ras、PIK3CA突变率明显大于BRAF的突变率,K-ras、PIK3CA基因突变是结直肠癌中的常见生物学事件,可能参与了结直肠癌的发生,而BRAF基因突变可能不是结直肠癌发生的主要分子机制,K-ras、PIK3CA与直肠癌患者的TNM分期存在密切的关联.
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广西非小细胞肺癌组织K-ras癌基因mRNA表达的研究
目的 探讨广西非小细胞肺癌(NSCLC)组织K-ras癌基因mRNA表达及其与肺癌各临床病理特征的关系.方法 应用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测86例广西的NSCLC患者癌组织(肺癌组)和31例癌旁组织(肺组织组)中K-ras癌基因mRNA表达.结果 肺癌组K-ras癌基因mRNA表达率为80.2%(69/86),显著高于肺组织组的51.6%(16/31),差异有统计学意义(P＜0.01);K-ras癌基因mRNA表达与年龄、性别、民族、吸烟史、病理类型、肿瘤细胞分化程度、TNM分期及淋巴结状态等均无统计学相关(P＞0.05).结论 K-ras癌基因的过度表达参与了NSCLC的发生,但与广西NSCLC的发展及预后无关.
关键词： 非小细胞肺癌 K-RAS 癌基因 反转录-聚合酶链反应 -
314例中国胃癌患者K-ras基因的突变状态分析
目的：分析胃癌患者K‐ras基因突变状态，以期为胃癌患者的个体化治疗提供指导。方法采用嵌套和COLD‐PCR的方法分析314例胃癌患者K‐ras基因突变状态。结果在314例胃癌患者中，K‐ras基因总体突变率是7．32％。19例血浆标本的突变率为0％。295例组织标本的突变率为7．80％。突变类型包括G12D、G13D、G12V ，两种不同标本之间K‐ras基因的突变率并无显著差异（ P＝0．2061）；221例男性患者的突变率为6．79％，突变类型包括G12D、G13D ，93例女性患者的突变率为8．60％，突变类型包括G12D、G13D、G12V ，不同性别之间K‐ras基因的突变率之间无显著差异（P＝0．5731）；45例青年人患者的突变率为6．67％，突变类型包括G12D、G13D ，127例中年人患者的突变率为7．87％，突变类型包括G12D、G13D、G12V ，142例老年人患者的突变率为7．04％，突变类型包括G12D、G13D ，不同年龄患者K‐ras基因的突变率之间无显著差异（ P＝0．9953）。结论314例胃癌患者K‐ras基因突变率是7．32％，突变类型主要为G12D、G13D ，K‐ras基因在不同标本类型、不同性别、不同年龄之间的突变率并无显著差异。
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晚期结直肠癌患者血浆cfDNA中K-RAS突变及与西妥昔单抗耐药的关系研究
目的 探讨晚期结直肠癌患者cfDNA中K-RAS的含量变化,以及K-RAS与结直肠癌患者用药的关系及其预后价值.方法 选取晚期结直肠癌患者100例,从EDTA血液样品获得血浆,使用ARMS-PCR评估K-RAS突变等位基因,收集病例,并统计K-RAS突变状态与表皮生长因子受体(EGFR)单抗的药物疗效关系,分析K-RAS基因突变对总生存期(OS)和无疾病生存期(PFS)的影响.结果 cfDNA和组织中均检测出的K-RAS突变的一致性为62.50％,治疗前K-RAS在cfDNA中的突变丰度为(17.00±12.05)％,经过标准治疗后为(8.10±7.98)％;同样,在组织中检测出,治疗前K-RAS在组织中的突变丰度为(26.40±9.80)％,经过标准治疗后为(12.60±2.55)％;K-RAS野生型患者在使用EGFR单抗中会随着疾病的进展而出现K-RAS突变丰度增多的现象,且K-RAS的表达情况与临床PFS和OS正相关.结论 血浆中K-RAS检测可指导临床用药,具有一定预后判断价值.
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K-ras基因型与直肠癌术前放化疗后肿瘤病理消退的相关性研究
目的:探讨K-ras基因突变是否可作为直肠癌术前放化疗后肿瘤组织病理消退的预测因子.方法:收集我院行术前放化疗的Ⅱ、Ⅲ期直肠癌患者46例,通过放化疗前活检石蜡包埋组织获取DNA样本,经PCR扩增后测序,明确K-ras基因第12、13密码子突变情况.根据Dwork's直肠癌肿瘤消退分级标准评定放化疗后肿瘤组织的病理改变,将TRG2+3+4定义为肿瘤组织消退良好,TRG0+1肿瘤组织无明显消退.结果:46例患者中成功提取DNA 43例,K-ras基因突变15例(34.9％),其中第12密码子突变11例(73.3％),第13密码子突变4例(26.7％).43例患者中TRG2+3+4者29例(67.4％),TRG0+1者14例(32.6％).K-ras基因突变组和野生组肿瘤组织消退良好者分别为66.7％和67.8％,2组相比差异无统计学意义(P=0.793).结论:在K-ras 基因突变型和野生型的直肠癌患者中,术前放化疗后直肠肿瘤病理消退程度无差异,K-ras基因突变不能作为直肠癌术前放化疗后肿瘤组织病理消退的预测因子.
