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T4噬菌体表面展示技术的研究进展
噬菌体表面展示技术(phage display)是由Smith于1985年首先建立起来的一种新的生物技术[1],它能将表达的外源多肽或蛋白以融合蛋白的形式展示在噬菌体的表面,保持相对独立的空间构象和原有的生物活性[2].常用的噬菌体表面展示系统主要有丝状噬菌体、λ噬菌体及T4噬菌体展示系统等.虽然它们都具有噬菌体展示系统的优点,但对于丝状噬菌体来说,它不能展示那些难以分泌的肽和蛋白质,而且它的N端可融合外源多肽的容量有限,较大蛋白的融合会造成空间障碍,影响噬菌体的装配,使其失去感染力.而对于λ噬菌体,大分子蛋白的融合会抑制噬菌体的组装,使其生长受到影响,因此这两种噬菌体更适用于构建短肽库和cDNA表达文库[3],而不适于构建重组疫苗和表达分子量大具有完整结构域的蛋白质[4,5].
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人源性大肠癌抗原基因的SEREX筛选
目的:寻找人源性大肠癌相关抗原基因.方法:构建3个以入Tripl Ex2噬菌体作载体的大肠癌抗原cDNA表达文库,用自体或异体大肠癌患者血清应用SEREX方法进行免疫筛选.用平板法扩增阳性克隆噬菌体,提取纯化DNA,用SfiI酶切和PCR鉴定插入片段的大小.结果:构建成3个大肠癌抗原cDNA噬菌体表达文库,滴度分别为2.39×106nfu/L,2.07×106nfu/L和1.86×106nfu/L,插入片段长度为0.5-4kb,平均分别为1.4kb,1.6kb和1.3kb.筛选发现4个阳性克隆,插入cDNA片段大小分别为2.4 kb,1.8 kb,2.3 kb和2.2 kb.结论:用SEREX方法筛选大肠癌抗原cDNA表达文库,可获得有价值的大肠癌的重组抗原基因克隆,将有利于大肠癌的早期诊断和重组疫苗的研究.
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丙型肝炎病毒复制的研究进展
丙型肝炎病毒(HCV)感染是全球范围内导致慢性肝炎、肝硬化以及肝癌的重要原因.1989年,对一位输血后非甲非乙型肝炎患者的血清表达文库进行免疫筛选后,首次证实了HCV的存在[1].但HCV很难被直接观察到,也无法在体外进行有效的培养,这妨碍了病毒生命周期的阐明以及特异性抗病毒药物和预防性疫苗的发展.尽管存在种种障碍,在过去的18年中对HCV的研究还是取得了重大进展,主要通过异源表达系统、黑猩猩体内感染的功能性cDNA克隆、复制子(replicon)系统和假病毒(膜表面为功能性HCV包膜蛋白的逆转录病毒颗粒, HCVpp)以及HCVcc(细胞培养来源的HCV)等来实现的.本文就近年来HCV复制方面的研究进展作一综述.
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肝细胞癌肿瘤抗原分子生物学辨认与应用研究
肝细胞癌(HCC)是病死率很高的一种恶性肿瘤,目前,HCC的诊断与治疗技术亟待改善.特异性肝癌抗原的辨认及其与宿主的关系的探讨对特异性的肝癌的诊断及免疫治疗有极其重要的意义.广西是肝细胞癌(HCC)高发区,对肝癌抗原的识别辨认具有更加重大的现实意义.SEREX技术是Sahin等于1995年创立的一种新的肿瘤抗原筛选技术.它是以肿瘤患者能对其自身肿瘤抗原产生体液免疫反应为基础,利用肿瘤患者自体血清来筛选肿瘤细胞cDNA表达文库,从而获得肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原的方法.相对于传统方法来说,SEREX技术相对省时节支,而且操作起来也较为简单,很快得到了广泛的应用.
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羊种布氏杆菌核酸疫苗的制备及其免疫效果
目的:构建羊种布氏杆菌基因组DNA表达文库,并研究其免疫效果.方法:将羊布氏杆菌基因组DNA经限制性内切酶Hind III消化后,克隆入pSV-β-Gal质粒,构建含羊布氏杆菌基因组DNA酶切片段的表达文库,用构建的表达文库经股四头肌免疫小鼠.结果:从文库中筛选了26个含羊种布氏杆菌基因组DNA片段的细菌克隆 ;免疫小鼠,可以刺激小鼠产生羊种布氏菌凝集抗体,并使淋巴细胞转化率明显增高.结论:构建的羊布氏杆菌基因组DNA表达文库可以刺激小鼠产生体液免疫应答和细胞免疫应答,此工作为制备有效的布氏杆菌及其它胞内寄生菌疫苗提供了实验基础.
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074用cDNA表达文库连续分组免疫鉴定实验性内脏利什曼病疫苗候选分子
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大肠癌中干扰素诱导的跨膜蛋白-1基因表达及其临床意义
大肠癌(colorectal cancer,CRC)是消化系统常见恶性肿瘤,早期诊断还缺乏简易有效的手段,筛选大肠癌的肿瘤标志物十分必要.我们通过血清学筛选重组cDNA表达文库(SEREX)方法筛选出干扰素诱导的跨膜蛋白-1(interferon-induced transmembrane protein-1,IFITMP-1)基因[1],进一步研究其在大肠癌中的表达及临床意义.
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乳腺癌新指标的筛选及其临床价值验证
CA15-3是目前应用多的乳腺癌指标[1],但只有不足10%的早期乳腺癌和30%~75%的晚期乳腺癌患者中出现阳性结果[2].相对血清抗原检测,血清抗体检测的灵敏度更高,理论和研究也证实抗体较抗原具更大的早期诊断价值[3].我们利用噬菌体展示技术从全基因组表达文库中筛选乳腺癌新指标,比较乳腺癌病灶组织和血清中新指标表达的相关性,验证其在乳腺癌诊断和预后中的临床应用价值.
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人食管癌细胞cDNA表达文库的构建和鉴定
目的 构建人食管癌细胞cDNA噬菌体表达文库.方法 从食管癌细胞中提取总RNA,利用磁珠吸附法分离其中的mRNA,逆转录合成cDNA第一链,再通过碱基互补配对原则合成第二链,对双链cDNA进行末端修饰,连接EcoR Ⅰ适配子,磷酸化EcoR Ⅰ适配子5'端,除去不合要求的cDNA片段,将符合要求的与载体(噬菌体T7 Select10-3b)连接,然后进行体外包装建成初步的cDNA文库,并对文库进行鉴定.结果 食管癌细胞cDNA原始表达文库的滴度为2.01×106 pfu/mL,重组率高达100%,插入片段的大小范围在300~1 500 bp之间.结论 本实验成功构建了人食管癌T7噬菌体展示cDNA表达文库,并经过了初步鉴定,为下一步利用重组表达cDNA克隆的血清学分析技术(SEREX技术)鉴定食管癌相关抗原奠定基础.
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藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库的构建及初步鉴定
目的:构建藜草花粉变应原λ噬菌体cDNA表达文库,并进行初步鉴定.方法:用TRIzol试剂抽提藜草花粉总RNA并分离mRNA.以纯化的mRNA为模板,以含有Xho I内切酶位点和18 by的Poly(dT)序列的引物,用ZAP Express cDNA合成试剂盒反转录合成cDNA.将cDNA修饰、分级纯化后,获得大于400 by的cDNA片段.将带有黏性末端的双链ds cD-NA与Uni-ZAP XR载体连接,采用ZAP Express cDNA文库合成试剂盒利用λ噬菌体构建藜草花粉λ噬菌体cDNA表达文库,用包装蛋白对合成的ds cDNA进行体外包装,以包装产物感染宿主菌XL1-Blue MRF即获得cDNA表达文库.用PCR方法检测cDNA表达文库的滴度和插人片段的大小.结果:构建的藜草花粉变应原λ噬菌体表达文库的滴度为9.7×10(8)pfu/L,重组率为100%,库容量为4.85pfu.插人片段的长度平均约为1.0 kb.结论:构建的cDNA表达文库的容量及插人片段的大小合适,适用于藜草花粉变应原cDNA克隆的筛选,为制备基因重组藜草花粉变应原疫苗奠定了基础.
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葎草花粉cDNA表达文库的构建和初步鉴定
目的 构建葎草花粉cDNA表达文库,为进一步筛选葎草花粉的主要致敏蛋白组分、制备重组变应原奠定基础.方法 采集新鲜葎草花粉,过筛后液氮保存,利用Trizol法抽提葎草花粉总RNA,纯化后PCR法反转录合成cDNA.经S fiⅠ酶切,过凝胶柱层析,去除小于400 bp的片断,收集大于400 bp的cDNA片段,加工后与λTripIEx2连接,文库体外包装,取出一小部分感染宿主菌XL1-Blue MRF,检测文库容量;PCR分析插入的cDNA片段的大小及多样性.结果 成功构建一个含有5×105重组子的葎草花粉表达文库,重组率为90%,平均插入片段长度约为1.02kb.结论 所建文库容量及插入片段大小合适,适用于筛选克隆的目的cDNA.