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hTERT干扰真核表达载体的构建及鉴定
目的构建和鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)干扰真核表达载体.方法人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small interfereace RNA)真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo;采用PCR、酶切和测序鉴定.结果成功构建了hTERT干扰真核表达载体.结论hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础.
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Htert、CD133和c-myc在胃癌中的表达
目的 探讨肿瘤干细胞及其Wnt信号通路表达在胃癌患者中的作用机制.方法 利用免疫组化技术分析c-myc基因蛋白、hTERT及CD133在慢性非萎缩性胃炎、慢性萎缩性胃炎(伴肠化生或异型增生)、早期胃癌患者非炎症区组织中的表达,并对其进行比较.结果 在早期胃癌组与慢性萎缩性胃炎组,c-myc基因蛋白、hTERT及CD133的表达均明显高于慢性非萎缩性胃炎组(P＜0.05);但早期胃癌组与慢性萎缩性胃炎组相比,c-myc基因蛋白、hTERT及CD133的表达差异无统计学意义(P＞0.05).结论 胃癌和胃癌前病变与c-myc基因蛋白、hTERT及CD133的过表达密切相关,在胃癌发病中具有重要意义.
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hTERT和survivin在膀胱移行细胞癌中的表达及意义
目的探讨膀胱移行细胞癌(TCCB)中hTERT和survivin的表达及意义.方法采用免疫组化S-P法检测hTERT和survivin在84例TCCB和15例正常膀胱黏膜组织中的表达.结果84例TCCB中hTERT、survivin的阳性表达率分别为83.3%(70/84)、48.8%(41/84);hTERT表达的阳性率与TCCB的病理分期、分级无相关性;survivin表达的阳性率与TCCB的病理分期、分级有相关性;hTERT与survivin表达之间具有相关性.结论 hTERT和survivin的表达均参与了膀胱癌的发生发展过程,survivin和hTERT在恶性肿瘤的发生、发展中具有协同作用.
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B72和hTERT的真核表达载体的构建与鉴定
目的:构建同时表达B72和hTERT的真核表达载体.方法:根据GenBank中的序列,对B72、hTERT各设计一对两端带特定限制性酶切位点的引物,分别从乳腺组织、乳癌组织提取总RNA,进行RT-PCR后,将2扩增产物分别克隆在pGEM-T载体,然后双酶切各pGEM-T载体,回收目的片段,将2目的片段再克隆至真核表达质粒pEGFP-C3中,并对重组体进行PCR鉴定和测序分析.结果:PCR扩增片段与预期结果相符,B72/hTERT真核表达载体构建成功,插入片段测序结果与GenBank公布的基因一致.结论:成功构建B72/hTERT真核表达载体.
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hTERT片段真核表达质粒的构建
目的:构建人端粒酶逆转录酶(hTERT)片段的真核表达质粒,方法:从肿瘤组织中提取总RNA,采用RT-PCR法扩增hTERT基因并克隆入PGEM-T Easy载体中,然后再亚克隆于pcDNA3.1真核表达载体,用PCR扩增及限制性酶切法筛选重组真核表达质粒,并以DNA测序鉴定.结果:PCR扩增及限制性酶切法证实重组真核表达质粒的构建成功.测序表明,hTERT基因片段与GenBank公布的相应基因同源性比较,核苷酸序列的同源性为98.73%,氨基酸序列的同源性为99.68%.结论:成功构建了hTERT真核表达质粒,为进一步研究与hTERT相关的抗肿瘤免疫治疗奠定了基础.
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食管癌和淋巴结转移组织中c-myc,hTERT和c-MET蛋白的表达
目的:探讨食管癌和淋巴结转移组织中c-myc、hTERT和c-MET的表达.方法:利用组织微阵列技术,采用免疫组化ABC法,测定58例食管癌及其相应的癌旁组织、8例转移淋巴结组织中c-myc、hTERT和c-MET的表达.结果:癌旁、癌及淋巴结转移组织中c-myc阳性率分别为7%,66%,75%;hTERT阳性率分别为0%,48%,75%;c-MET阳性率分别为7%,34%,75%;癌旁和癌组织间c-myc和hTERT的表达差异有统计学意义(P＜0.05),癌旁和癌组织间,以及癌和淋巴结转移灶之间c-MET的表达差异均有统计学意义(P＜0.05).食管癌组织中c-myc与hTERT的表达呈正相关(r=0.411,P=0.002),c-myc与c-MET的表达不相关(r=0.211,P=0.146).结论:c-myc、hTERT和c-MET的高表达可能与食管癌发生发展相关,c-myc可能参与了hTERT的激活过程,c-MET的高表达可能参与了食管癌淋巴结的转移过程.
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端粒酶催化亚基hTERT调控Hela细胞周期的实验研究
目的 探讨hTERT基因与细胞周期因子之间的关系,从细胞周期调控的角度研究反义hTERT影响肿瘤细胞生长的机制.方法 脂质体介导将hTERT反义寡核苷酸(hTERT-ASODN)转染到Hela细胞中,运用RT-PCR方法分析hTERT-ASODN对细胞周期相关基因表达水平的改变,流式细胞仪技术检测细胞周期分布的变化.结果 hTERT-ASODN可在mRNA水平封闭Hela细胞中hTERT基因的表达,并使细胞周期相关基因如CyclinE1,CyclinB1,CyclinD1的表达水平出现明显变化.流式细胞仪的检测结果显示,hTERT-ASODN转染组的细胞数在G0/G1期增多,而在S期及G2/M期减少,但无特征性的凋亡峰出现.结论 hTERT基因参与调控肿瘤细胞中相关细胞周期因子的表达.
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枸杞多糖对小鼠移植性肝癌端粒酶活性及hTERT蛋白表达的影响
目的 探索枸杞多糖(Lycium barbarum polysaccharides,LBP)对小鼠移植性肝癌端粒酶活性及其限速酶hTERT表达的影响.方法 采用皮下接种法建立小鼠移植性肝癌模型,将96只小鼠随机分成正常对照组,模型组,LBP高、中、低(20,10,5 mg/kg·d)剂量组和环磷酰胺(20 mg/kg·d)组.观察LBP对小鼠肿瘤体积、抑瘤率的影响.PCR-TRAP-ELISA 法检测端粒酶的活性,Western blot测定hTERT蛋白表达.结果 20,10,5 mg/kg·d的LBP能明显减小肿瘤细胞的体积和质量(P＜0.05),抑瘤率分别为42.23％、25.10％和9.16％；同时,LBP(20,10mg/kg·d)能明显抑制肝癌组织hTERT蛋白表达(P＜0.05),降低端粒酶的活性(P＜0.05).结论 LBP可通过抑制小鼠肝癌组织hTERT蛋白表达、降低端粒酶的活性,从而对小鼠移植性肝癌的生长起到抑制作用.
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人端粒酶催化亚单位hTERT启动子的研究进展
近几年来随着对端粒酶及其调控机制的研究不断深入,逐渐认识到hTERT仅仅在端粒酶阳性的肿瘤细胞中高表达,在端粒酶阴性的细胞中不表达.
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PTEN与hTERT在肝细胞肝癌中的表达及其相关性研究
目的研究肝细胞肝癌组织中PTEN与hTERT的表达及其意义,并探讨两者在肝细胞肝癌中表达的相关性.方法应用免疫组织化学(SP法)和半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)分析58例肝细胞肝癌及对应癌旁组织中PTEN蛋白及PTENmRNA、hTERT蛋白及hTERTmRNA的表达情况,并探讨两者表达的相关性.结果PTEN蛋白明确定位于肝细胞胞浆内.PTENmRNA和PTEN蛋白在肝细胞肝癌中的阳性率分别为41.38%(24/58)、44.83%(26/58),明显低于癌旁肝组织的阳性率100%(58/58),差异有统计学意义(P＜0.01).hTERT蛋白主要表达于肝细胞胞浆内,偶见核内表达.hTERTmRNA和hTERT蛋白在肝细胞肝癌中的阳性率分别为82.76%(48/58)和87.93%(51/58),明显高于癌旁组织中的阳性率24.14%(14/58)、27.59%(16/58),差异有统计学意义(P＜0.01).相关分析显示,PTEN与hTERT在肝细胞肝癌中的表达呈负相关(P＜0.05).结论PTEN、hTERT在肝细胞肝癌的发生发展中起重要作用,有可能成为肝细胞肝癌的重要分子生物学检测指标,且两者表达呈负相关,提示PTEN可能在肝细胞肝癌的发生发展过程中对hTERT的活化起着调控作用.
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永生化人骨髓基质干细胞株MSCxj的转化特征
我们通过转染外源性人端粒酶催化亚单位(hTERT)基因建立永生化人骨髓基质干细胞株MSCxj[1].我们已报告了MSCxj细胞形态学和生长增殖等两个方面的生物学特征[2].本实验旨在观察该细胞株是否具有其他转化特征.
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端粒酶逆转录酶-siRNA抑制胆囊癌细胞端粒酶活性及代谢侵袭的研究
目的 了解端粒酶逆转录酶(hTERT)-siRNA对GBC-SD细胞代谢、侵袭和端粒酶活性、hTERT mRNA、hTERT蛋白、β-catenin mRNA、β-catenin蛋白的作用,并探讨其相关机制.方法 在质粒pGCsi-H1/GFP-hTERT干扰后,采用端粒酶TRAP、半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法检测GBC-SD端粒酶活性、hTERT基因和β-catenin基因mRNA、蛋白质表达水平.噻唑蓝(MTT)比色法检测琥珀酸脱氢酶(SDH)活性、运用Transwell小室了解癌细胞侵袭情况.结果 pGCsi-H1/GFP-hTERT对GBC-SD端粒酶活性、SDH活性、侵袭、hTERT mRNA、hTERT蛋白均有抑制作用并随浓度升高而增强.pGCsi-H1/NEGative对上述指标无明显抑制作用,与pGCsi-H1/GFP-hTERT抑制作用比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 pGCsi-H1/GFP-hTERT可以抑制端粒酶、SDH活性及其侵袭力,其机制与hTERT mRNA及蛋白表达降低有关.
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外周血DNA和hTERT在肺癌诊断中的应用
目的 检测肺癌患者血清DNA含量及Htert的表达水平,寻求微创、高敏感性及特异性的检测方法,为肺癌早期诊断提供新指标.方法 41例病理证实肺癌患者,22例正常人设为对照组.磁珠悬浮法提取测定血清DNA含量;巢式PCR法扩增血清Htert片段,测定灰度比.结果 肺癌患者、正常人血清DNA含量均数分别为33.464和18.420,肺癌组血清DNA浓度显著高于正常对照组(P<0.01).巢式PCR法扩增血清Htert片段,测定灰度比作为诊断分界点,绘制ROC曲线,AZ=0.852,AZ的95%置信区间为CI(0.750,0.953,P=0.000),因此可以认为血清Htert对于肺癌的诊断具有中等准确性.诊断分界点=0.4时,其Kappa=0.477,(P<0.01),有统计学意义,其与病理诊断的一致性较好.结论 外周血DNA和Htert在肺癌诊断中具有较好的敏感性和特异性,可能成为肺癌早期诊断的新检测手段.
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端粒酶逆转录酶在侵袭性垂体腺瘤中的表达及意义
目的 探讨人类端粒酶逆转录酶(hTERT)在侵袭性垂体腺瘤中的表达及其意义.方法 采用端粒末端重复扩大-聚合酶链反应(TRAP-PCR)方法 检测hTERT在18例侵袭性垂体腺瘤和24例非侵袭性垂体腺瘤中的表达情况并做统计学分析.结果 hTERT基因在22.2%(4/18)的侵袭性垂体腺瘤中有所表达,与非侵袭性垂体腺瘤(0.0%,0/24)相比,差异显著(P＜0.05);且在hTERT表达阳性的侵袭性垂体腺瘤中,其hTERTmRNA表达量显著高于hTERT表达阴性的侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤(P＜0.05);电泳结果 显示hTERT阳性病例中其表达均为中低度表达.结论 hTERT与垂体腺瘤的侵袭性生长行为有关,可用来对侵袭性垂体腺瘤进行早期诊断以及判断预后.
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舌鳞癌中hTERT与PTEN表达的相关性研究
目的:探讨舌鳞状细胞癌组织中hTERT与PTEN蛋白表达的相关关系,为治疗原发性舌鳞癌提供理论依据.方法:采用免疫组织化学技术及原位杂交技术,对原发性舌鳞癌组织、癌旁组织(正常组织)中hTERT和PTEN蛋白表达进行检测.利用计算机图像分析技术,将二者中hTERT和PTEN蛋白水平进行半定量分析.在此基础上,应用有关统计学方法,评价hTERT与PTEN之间是否存在相关性及其相关程度.结果:舌鳞癌中hTERT和PTEN蛋白的阳性检出率分别为74.5%(37/50)和39.1%(20/50).且随着肿瘤恶性程度的增加,hTERT的表达升高,PTEN的表达下降,二者之间存在相关性(P<0.01).结论:抑癌基因PTEN在舌鳞状细胞癌中对hTERT活化的可能存在抑制作用,PTEN的缺失可能引起hTERT表达水平增高从而导致舌癌的发生.
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hTERT-siRNA抑制胆囊癌细胞端粒酶活性及增殖运动的研究
目的:了解hTERT-siRNA对GBC-SD细胞代谢、侵袭和端粒酶活性、hTERT mRNA、hTERT蛋白、β-catenin mRNA、β-catenin蛋白的作用,并探讨其相关机制.方法:在质粒pGCsi-H1/GFP-hTERT干扰后,采用端粒酶TRAP、半定量RT-PCR和Western blot方法检测胆囊癌细胞GBC-SD端粒酶活性、hTERT基因和β-catenin基因mRNA、蛋白质表达水平;四甲基偶氮唑蓝(MTT)光吸收法检测琥珀酸脱氢酶(SDH)活性、运用Transwell小室了解癌细胞侵袭情况.结果:pGCsi-H1/GFP-hTERT对GBC-SD端粒酶活性、SDH活性、侵袭、hTERT mRNA、hTERT蛋白均有抑制作用并随浓度升高而增强.pGCsi-H1/NEGative对上述指标无明显抑制作用,与pGCsi-H1/GFP-hTERT抑制作用比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论:pGCsi-H1/GFP-hTERT可以抑制端粒酶、SDH活性及其侵袭力,其机制与hTERT mRNA及蛋白表达降低有关.
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抑制hTERT表达对喉癌细胞凋亡及其相关蛋白的影响
目的探讨RNA干扰抑制端粒酶逆转录酶(human telomerase revese transcriptase, hTERT)对喉癌Hep-2细胞凋亡、P53及Caspase-3蛋白表达的影响.方法根据hTERT cDNA序列构建表达hTERT mRNA特异的、含荧光素基因的shRNA真核表达质粒pshRNA1,随机选取一段与人类基因无同源性的碱基序列构建表达shRNA的含荧光素基因的对照质粒pshRNA2,采用METAFECTENE作为转染试剂.分别以质粒pshRNA1 、pshRNA2及空白培养液转染喉癌Hep-2细胞.电镜下观测细胞凋亡小体的形成,TUNEL法检测细胞的原位凋亡,Western Blot法检测hTERT、P53、Caspase-3蛋白表达水平.结果 pshRNA1转染组hTERT蛋白表达显著下调,大量Hep-2细胞凋亡,电镜显示凋亡小体形成.pshRNA1转染组P53和Caspase-3蛋白表达水平显著高于其他处理组及空白对照组(P＜0.001),二者升高趋势具有相关性(相关系数r=0.088,P＜0.05).结论 RNAi抑制hTERT基因表达能有效诱导喉癌细胞凋亡,其可能的分子机制是诱导P53及Caspase-3蛋白表达上调.
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姜黄素抑制NF-κB信号对人肝癌HepG2细胞株增殖的影响
目的 探讨姜黄素对HepG2细胞株增殖的影响及其机制.方法 不同浓度的姜黄素(0、1.0、3.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μmol·L-1)处理HepG2细胞株不同时间后,MTT法检测肝癌细胞株增殖情况;RT-PCR检测NF-λBp65和hTERT mRNA表达;Westem blot检测hTERT蛋白表达,细胞免疫荧光法检测HepG2肝癌细胞株中NF-κB活性.结果 姜黄素能明显抑制HepG2细胞的增殖,且呈时间与浓度依赖性;姜黄素能显著抑制NF-κBp65 mRNA表达及活性,同时伴有hTERT mRNA及蛋白表达降低.结论 姜黄素抑制肝癌细胞株增殖,可能通过抑制NF-λBp65调控hTERT表达,进而下调端粒酶活性有关.
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高通量端粒酶抑制剂筛选模型融合表达载体的构建及转化
目的 构建含不同结构域的人端粒酶逆转录酶(hTERT)酵母三杂交系统融合蛋白表达载体并转化酵母.方法 采用PCR法从pCLXSN-hTERT质粒中提取不同的hTERT cDNA片段,纯化分离定向克隆到pYESTrp3质粒,构建包含不同hTERT蛋白结构域的编码序列的重组质粒,转化大肠杆菌,经PCR、酶切、测序鉴定,将阳性重组质粒转化酵母菌,进行毒性和自激活检验.结果 经过测序验证,重组融合蛋白表达载体pYESTrp3-hTERT构建成功,转化酵母无毒性和自激活性.结论 成功构建能用于酵母三杂交系统的融合蛋白表达载体,可于酵母三杂交系统筛选端粒酶抑制剂及hTERT和hTR间的相互作用.
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凋亡相关蛋白Survivin及hTERT mRNA在肾细胞癌中的表达及意义
目的 研究凋亡抑制蛋白Survivir和hTERT mRNA在肾细胞癌组织中的表达及意义.方法 采用免疫组化和原位杂交法检测46例肾细胞癌组织和15例对照组织(癌旁正常肾组织)中Survivin蛋白和hTERT mRNA的表达.结果 46例肾细胞癌组织中Survivin的阳性表达39例,阳性表达率为84.78%,而15例正常组织中Survivin蛋白仅1例阳性表达,阳性率为6.67%,肾细胞癌组织Survivin蛋白的阳性表达率与正常比较差异有显著性(P＜0.01);46例肾细胞癌组织中hTERT mRNA阳性表达41例,阳性率为89.13%,15例正常组织中hTERT mRNA阳性表达仅有1例,阳性率为6.67%,两组hTERT mRNA阳性表达率差异有显著性(P＜0.01).结论 肾细胞癌组织中存在Survivin蛋白和hTERT mRNA过表达,这可能与肾细胞癌的发生发展有关.
