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突触小体相关蛋白-47在肺腺癌中的表达及其临床意义
目的 检测人肺腺癌细胞株、组织及其对应的癌旁肺组织中突触小体相关蛋白(SNAP47)的表达,研究SNAP47与肺腺癌发生和侵袭转移的关系,探讨其在肺腺癌发生、发展中的作用.方法 选取常见人肺腺癌细胞株并随机选取有完整临床资料的50例肺腺癌组织和对应的癌旁肺组织,应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测SNAP47 mRNA的表达.结果 SNAP47 mRNA在肺腺癌细胞株中的表达明显高于正常肺上皮细胞株(P＜0.05);50例肺腺癌组织中33例(66％) SNAP47 mRNA表达水平明显高于对应的癌旁肺组织,差异有统计学意义(P＜0.05),且SNAP47 mRNA表达与淋巴结转移、病理分期相关.结论 SNAP47 mRNA高表达可能与肺腺癌的发生有关,参与了肺腺癌的浸润及淋巴转移.
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微小RNA-10b在不同分化程度胃癌细胞株中的表达
目的 观察微小RNA-10b(miR-10b)在不同分化程度的胃癌细胞株中的表达水平.方法 选择5种胃癌细胞株,根据其不同分化程度分为3组,即高分化组(AGS)、中分化组(N87、SGC-7901)、低分化组(MKN-45、BGC-823),以胃黏膜上皮永生化细胞GES-1为第4组,即正常组,通过实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)和荧光素酶报告基因定量检测,观察miR-10b在6种不同分化水平的细胞株中的表达.结果 miR-10b在正常组及高分化组中几乎不存在表达,设定其在GES-1中的表达量为1.0,高分化组相对表达量为2.5,中分化组弱表达,相对表达量为7.5、7.0,在包括BGC-823、MKN45这种具有高度转移倾向的低分化组中明显高表达,相对表达量为10.5、12.5.结论 miR-10b在低分化胃癌细胞株中过表达,同时其表达水平与胃癌细胞侵袭转移能力呈正相关.
关键词： 胃癌细胞株 微小RNA-10b 实时定量聚合酶链反应 -
转化生长因子-β1因子在小肠移植物中的表达及意义
转化生长因子-β1 (TGF-β1)是近年来发现的与器官移植慢性排斥反应密切相关的因子之一.我们通过观察大鼠小肠移植物中TGF-β1因子的变化,探讨其在小肠移植中的作用及意义.一、材料与方法选用近交系F344( RT11vr)大鼠和Lewis( RT11)大鼠作为小肠移植的供体和受体.参照传统手术方法构建大鼠小肠移植模型[1].异系移植受体大鼠术后肌注环孢素,术后29 d停止给药.同系对照组肌注同体积生理盐水.分别于术后第7、28、60天切取部分移植物.采用荧光实时定量聚合酶链反应(PCR)技术检测TGF-β1 mRNA转录水平.应用SP法进行移植物的TGF-β1免疫组织化学检测.应用SPSS 13.0统计软件分析.
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敲除NET-1基因对肺癌细胞行为和肿瘤生长的影响
NET-1基因是新近报道的肿瘤相关分子基因,与肿瘤细胞增殖、迁移、浸润相关.我们通过靶向性短发卡RNA( shRNA)敲除肺癌A549细胞中NET-1基因的表达,研究其对A549细胞癌生物学行为的影响,进一步制备荷人肺腺癌裸鼠移植瘤模型,观察沉默NET-1基因后对裸鼠体内肿瘤生长的影响,探讨肺癌中NET-1基因表达的意义.一、材料与方法将NET-1基因的shRNA真核表达载体转染A549细胞,实时定量聚合酶链反应( RT-qPCR)、Western blot法分别检测细胞内NET-1 mRNA和蛋白表达;细胞计数试剂盒(CCK-8)法和流式细胞仪分别检测增殖与不同周期细胞百分比;
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活动期与缓解期溃疡性结肠炎患者黏膜主要菌群研究
目的 比较活动期与缓解期溃疡性结肠炎(UC)之间的黏膜微生态(MAM).方法 收集21例正常对照、41例活动期UC和9例缓解期UC的结、直肠黏膜.采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测MAM主要菌群的数量.结果 与健康对照比较,UC黏膜总菌数无显著改变.球形梭菌(C.coccoides)、普拉梭菌在(F.prausnitzii)活动、缓解期UC结肠和直肠溃疡中显著减少(8％比22％,10％比22％,10％比22％,10％比22％,P＜0.05;4％比13％,7％比13％,4％比13％,4％比13％,P＜0.05).柔嫩梭菌(C.leptum)在活动、缓解期结肠溃疡,活动期直肠溃疡与非溃疡中显著减少(9％比22％,11％比22％,9％比22％,16％比22％,P＜0.05).大肠杆菌(E.coli)在活动、缓解期结肠溃疡以及活动期直肠溃疡与非溃疡中显著增加(21％比6％,21％比6％,P＜0.05;11％比6％,21％比6％,P＜0.05).缓解期结肠C.leptum显著高于活动期结肠(11％比9％,P ＜0.05),缓解期直肠普氏菌属(Prevotella)数量显著高于活动期直肠(2％比0％,P＜0.01).结论 活动与缓解期UC的MAM与健康对照不同,活动与缓解期之间黏膜主要菌群差异无统计学意义;MAM益生菌的减少及条件致病菌的增多,提示它们可能参与UC的发病与炎症的维持.
关键词： 溃疡性结肠炎 黏膜微生态 实时定量聚合酶链反应 -
上皮细胞黏附分子在非小细胞肺癌组织中表达及其临床意义
目的 探讨上皮细胞黏附分子(EpCAM)在非小细胞肺癌(NSCLC)中的表达及临床意义.方法 采用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法和免疫组织化学EnVision染色法分别检测64例NSCLC手术患者配对癌组织和远端正常组织中EpCAM mRNA和蛋白的表达水平,并分析其与临床病理特征的相关性.结果 NSCLC癌组织中EpCAM mRNA的表达水平显著高于远端正常组织(P＜0.01),64例配对癌组织中,44例EpCAM mRNA表达水平上调,上调表达的EpCAMmRNA表达与NSCLC的肿瘤大小和肿瘤分期显著相关(P＜0.05).免疫组织化学结果显示,EpCAM蛋白在NSCLC癌组织中阳性表达率较高,为59.38％ (38/64),与远端正常组织中阳性表达率(15.63％,10/64)比较有显著的相关性.且EpCAM蛋白表达与NSCLC的肿瘤大小和肿瘤分期显著相关(P＜0.05).结论 EpCAM在NSCLC发展过程中起着重要的作用,并有望成为抗NSCLC治疗的一个潜在生物学标志.
关键词： 上皮细胞黏附分子 非小细胞肺癌 实时定量聚合酶链反应 免疫组织化学 -
微小RNA181b在人肝癌中的表达及其意义
目的 观察微小RNA181b(miR-181b)在正常胚肝细胞株和肝癌细胞株中的表达,检测该微小RNA在正常肝组织及肝癌组织中的表达,探讨其在肝癌发生发展中的作用和意义.方法 应用实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)法检测miR-181b在1株人正常肝细胞(LO2)及2株人肝癌细胞(HepG2、SMMC7721)中的表达,同时收取35例肝细胞癌手术患者正常组织、癌周组织、癌组织,检测其表达并分析；细胞计数试剂盒(CCK-8)实验及细胞生长曲线检测miR-181b抑制剂对肝癌细胞增殖能力的影响.结果 miR-181b在肝癌细胞(HepG2、SMMC7721)中的表达比正常肝细胞LO2显著增高(0.582±0.032、0.716±0.045、0.255±0.039,P＜O.05),在癌组织中表达显著高于正常组织与癌周组织(0.636±0.038、0.156±0.005、0.167±0.023,P＜0.05),正常组织及癌周组织比较差异无统计学意义(P＞0.05)；miR-181b抑制剂使肝癌细胞增殖能力减弱.结论 miR-181b在肝癌细胞及肝癌组织中的高表达,可能与肝癌发生发展密切相关,抑制miR-181b的表达能够抑制肝癌细胞增殖.
关键词： 微小RNA181b 癌 肝细胞 实时定量聚合酶链反应 -
实时荧光定量Taqman探针法检测线粒体DNA1494C>T突变技术的建立及应用研究
目的 建立以实时荧光定量Taqman探针技术检测线粒体DNA(mitochondial DNA,mtDNA) 1494C>T突变的方法,实现快速、简便、准确筛查这一突变的目标.方法 设计针对mtDNA 1494C>T突变的Taqman MGB探针和引物,从解放军总医院聋病分子诊断中心耳聋DNA库随机选取标本96份,遵循双盲法原则,分别以实时荧光定量Taqman MGB探针法和序列测定方法检测1494C>T突变,对检测方法进行可靠性验证.结果 实时荧光定量Taqman MGB探针法检测mtDNA 1494C>T突变,反应时间由原来的12小时缩短到1.5小时,96例耳聋病例中发现mtDNA 1494C>T突变阳性患者11例,阴性85例,与直接测序法检测结果完全相符,未发现假阳性和假阴性.结论 实时荧光定量Taqman探针技术检测mtDNA 1494C>T突变的方法简单省时,结果准确直观,特异性强,敏感性高,适用于对母系遗传性聋mtDNA 1494C>T突变的大规模筛查或预防性检查.
关键词： 耳聋 线粒体DNA 实时定量聚合酶链反应 TaqMan 探针 -
IL-24在口腔鳞状细胞癌中的表达及其临床意义
目的:研究白细胞介素-24(IL-24)在口腔鳞状细胞癌(简称鳞癌)组织中的表达并探究其临床意义.方法:分别采用免疫组化和实时聚合酶链反应(Real-time PCR)技术的方法检测75例口腔鳞癌组织和30例正常口腔黏膜组织中IL-24的蛋白和基因表达.结果:免疫组化染色显示IL-24在口腔鳞癌组织中的阳性表达率45.33％(34/75)低于正常口腔黏膜组织中的阳性表达率70.00％(21/30)(P=0.022).IL-24的表达与口腔鳞癌的组织分化程度(P=0.002),淋巴结转移(P=0.033),临床分期(P=0.035)有密切相关性,与患者的性别(P=0.917)、年龄(P=0.812)、吸烟史(P=0.720)、饮酒史(P=0.847)及肿瘤生长部位(P=0.959)无相关性.Real-time PCR检测IL-24在不同病理分化时期口腔鳞癌组织和正常口腔黏膜组织中的基因表达水平,其高、中、低分化各组的平均表达水平分别为0.688、0.302、0.153,均低于正常口腔黏膜组织中的平均表达水平1.000 (P＜0.001).结论:IL-24在口腔鳞癌组织中呈低表达,该因子的表达情况与临床信息具有一定相关性,可初步认定为口腔鳞癌的候补抑癌基因.
关键词： 口腔鳞状细胞癌 白细胞介素-24 免疫组织化学 实时定量聚合酶链反应 -
p57Kip2在鼻咽癌中的表达及意义
目的 揭示p57Kip2在鼻咽癌中的表达情况和临床意义,并分析其可能的机制.方法 收集广州军区武汉总医院耳鼻喉科2005-06/2010-05月收治的鼻咽癌组织标本133例,对照组选取相同时间段该科室采集的鼻咽黏膜慢性炎症组织43例,实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,Realtime-PCR)法检测标本中p57Kip2以及人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tension homolog deleted on chromosome ten,PTEN)的表达情况,分析p57Kip2在鼻咽癌中表达的意义及其与PTEN表达的相关性.结果 p57Kip2在鼻咽癌组织中的表达低于对照组织(P＜0.01),p57Kip2水平与鼻咽癌转移呈显著负相关(P＜0.01),但是与患者性别、年龄等因素无关(P＞0.05),且p57Kip2在鼻咽癌中的表达与PTEN水平正相关.结论 p57Kip2可能在抑制鼻咽癌侵袭转移中发挥了重要作用,其机制可能是通过促进抑癌基因PTEN的表达.
关键词： p57KIP2 蛋白酪氨酸磷酸酶基因 鼻咽癌 实时定量聚合酶链反应 -
Plexin A1蛋白及mRNA在小鼠卵泡发育过程中的表达
目的:探讨Plexin A1在小鼠卵巢不同发育阶段的表达.方法:选择不同发育时期的C57BL/6j小鼠,采用免疫组织化学方法测定小鼠卵巢中Plexin A1蛋白水平的表达,实时定量聚合酶链反应(real-time PCR)方法检测Plexin A1 mRNA水平的表达.结果:Plexin A1蛋白在小鼠卵巢各级卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中均有表达.随着卵泡的不断发育,其在卵母细胞和颗粒细胞中的表达水平均逐渐增强.始基卵泡卵母细胞中的Plexin A1蛋白表达水平明显低于初级、次级和窦状卵泡的卵母细胞.始基卵泡颗粒细胞中未见明显Plexin A1蛋白表达,至初级卵泡阶段可见颗粒细胞开始有Plexin A1蛋白表达,其水平低于次级及窦状卵泡.闭锁卵泡中的Plexin A1呈强阳性表达,明显高于生长卵泡中的表达水平.Plexin A1 mRNA在卵巢组织中的表达水平随周(日)龄呈先升高后降低的趋势,5d,7d,3周小鼠卵巢中Plexin A1 mRNA表达水平分别为3d小鼠的1.56、1.26、0.79倍(P＜0.05),而2周小鼠卵巢中的Plexin A1 mRNA表达水平与3d小鼠相当(P＞0.05).结论:Plexin A1在不同级别的小鼠卵泡中均有表达,且表达水平随卵泡的不断生长发育而增强,但闭锁卵泡中表达强,提示Plexin A1在卵泡的生长发育及闭锁过程中可能发挥重要的调控作用.
关键词： Plexin A1 卵泡发育 免疫组织化学 实时定量聚合酶链反应 -
正己烷接触人群神经生长因子mRNA表达水平研究
目的 建立一种人神经生长因子(NGF)mRNA荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测方法,探讨接触时间对正己烷接触人群NGF mRNA表达水平的影响.方法 以接触正己烷工龄分组.设计引物、探针,检测对照组和接触正己烷各组之间的NGF mRNA水平.结果 利用该荧光定量PCR检测结果显示工龄＜2年组、2～6年组、＞6年组以及对照组的NGF mRNA以10为底的对数分别为(8.88 ±0.08)、(8.68±0.08)、(8.53±0.11)和(8.90±0.07)copies/L.2～6年组和＞6年组的NGF mRNA表达水平均低于对照组.各组内男女之间NGF mRNA表达水平比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 正己烷的毒性对于NGF mRNA的表达有明显的时间依赖关系,随着接触时间加长,NGF的表达逐渐减弱;所建立的检测方法特异性强,完全符合检测要求.
关键词： 正己炕 神经生长因子 实时定量聚合酶链反应 -
反式二羟环氧苯并(a)芘所致人支气管上皮细胞POLK基因高表达
目的 观察不同剂量反式二羟环氧苯并(a)芘(anti-BPDE)处理对人支气管上皮细胞(16HBE)POLK基因表达的影响.方法 分别以0.25、0.50、1.00、2.00 μmol/L 的反式-BPDE 1次或3次处理16HBE细胞,采用Taqman MGB探针实时定量聚合酶链反应方法相对定量POLK和POLZ基因表达, 同时对反式-BPDE转化的16HBE及肺癌H1299细胞 POLK基因表达进行了分析.结果 反式-BPDE 1次处理及3次处理可诱导正常16HBE POLK基因高表达.反式-BPDE转化16HBE和肺癌H1299细胞POLK基因表达明显增高,分别是正常16HBE的2.25和5.49倍.结论 反式-BPDE处理可致16 HBE POLK基因高表达.
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麻风杆菌 PCR 检测方法的优化及应用
目的：研建一种适用于临床中检测麻风杆菌（ ML）的分子生物学方法，并优化检测条件以提高检测方法的灵敏度。方法：用麻风杆菌纯DNA作模板，对PCR反应体系中模板浓度、引物浓度等反应条件进行优化，以建立高敏感性的PCR反应体系，并与实时荧光定量PCR（Real-time PCR）方法比较，对麻风病人标本进行检测，确定优化后两法的反应体系及两法的临床检测意义。结果：经过大量的实验比对表明，反应体系引物含量为0.2μL ×100μmol时，模板浓度10－1条ML／mL可以作为稳定的可检测到条带的模板浓度的下限。对52例各型麻风患者标本的检测结果显示常规 PCR 检测阳性数（49／52）略高于Real-time PCR（47／52），但Real-time PCR操作程序简单和需时短，且成本低。结论：通过对PCR反应条件中DNA模板浓度和引物浓度的优选，提高了PCR检测麻风杆菌DNA的灵敏度；对于不同PCR方法的选择方面， Real-time PCR 比常规 PCR 简捷快速，而常规 PCR 灵敏度略高于 Real-time PCR。
关键词： 麻风分枝杆菌 聚合酶链反应 实时定量聚合酶链反应 -
中药有效成分对HepG2细胞中CYP相关基因表达的影响
目的 观察8种中药有效成分对细胞色素P450酶(cytochrome P450,CYP)1A1,2E1,3A4和3A5基因表达的影响.方法 采用实时定量PCR技术检测HepG2细胞中各CYP mRNA的表达.结果 黄芩苷、黄芩素和青蒿素在不同浓度下均明显地诱导CYP1A1的表达.与黄芩苷和黄芩素相比,青蒿素对CYP1A1的诱导作用较弱.七叶皂苷钠、黄芩素和青蒿素能明显诱导CYP3A4的表达.结论 HepG2细胞可作为CYP诱导剂的体外筛选模型.黄芩苷、黄芩素、青蒿素和七叶皂苷钠对CYP1A1或CYP3A4的诱导作用,为中西药代谢性相互作用及毒理学研究提供了实验依据.
关键词： 中药有效成分 细胞色素P450酶 中西药相互作用 实时定量聚合酶链反应 -
实时定量聚合酶链反应检测心血管活性多肽apelin方法的建立
目的:建立实时定量聚合酶链反应(RQ-PCR)检测心血管活性多肽的方法,为快速、准确地分析心脏组织中apelin基因表达奠定基础.方法:根据心血管活性多肽apelin基因序列,设计并合成引物和荧光标记TaqMan探针.将逆转录-聚合酶链式反应扩增的apelin基因片段克隆至pGEM-T easy载体,重组质粒经蓝白筛选、酶切、测序鉴定后,作为阳性克隆标准品,用于标准曲线的制定,由此可定量检测出每一样品模板的起始拷贝数.结果:阳性克隆标准品制作的标准曲线可显示循环阈值与模板浓度具有良好的线性关系(r=0.970),可用于apelin基因表达的起始拷贝数定量测定.结论:RQ-PCR方法较常规PCR技术更为简便、准确、特异、灵敏,对定量检测及研究心血管活性多肽有积极意义.
关键词： 实时定量聚合酶链反应 心血管活性多肽 Apelin -
实时荧光定量 PCR检测野生型p53介导蛋白磷酸酶mRNA在非小细胞肺癌中的表达
[目的] 荧光染料Ⅰ(SYBR GreenⅠ)是一种较为常用的非探针类定量PCR的方法,其结果具有一定特异性.本研究的目的是建立检测野生型p53介导蛋白磷酸酶(Wip1)mRNA的SYBR GreenⅠ实时定量PCR的方法,了解肺癌组织及其远癌正常肺组织中Wip1的表达水平,研究肺癌组织中Wip1的表达水平与各种临床病理特征之间的关系. [方法] 利用相对定量的方法检测44例肺癌及相应远癌正常肺组织中Wip1 mRNA相对于β-actin mRNA的表达量,进行相对定量分析. [结果] 44例非小细胞肺癌(NSCLC)及相应远癌正常肺组织均有Wip1 mRNA的表达,其中17例非小细胞肺癌中Wip1 mRNA高表达,占38.6%,两者表达差异有统计学意义 (Ratio ＝ 2.1644 ± 1.394,P ＜ 0.05);分化程度低的肺癌组织中Wip1 mRNA表达量显著高于分化程度高者(F ＝ 5.08,P ＝ 0.013). [结论] SYBR GreenⅠ实时定量PCR方法可以成功地检测Wip1基因的表达量.初步检测结果显示Wip1可能是一种肺癌发生发展过程中的致癌因素.
关键词： 非小细胞肺癌 Wip1基因 实时定量聚合酶链反应 -
apelin-APJ在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺组织中的表达及其意义
目的：检测慢性阻塞性肺疾病（COPD）大鼠肺组织中 apelin 及其受体 APJ 的 mRNA 和蛋白表达，探讨apelin-APJ系统在COPD发生、发展中的作用。方法：烟雾暴露法制造COPD大鼠模型。实验设对照组和COPD组。 COPD组大鼠每日2次在熏烟箱内烟雾暴露，每次连续被动吸烟20支（1 h），持续4个月。qRT-PCR测定大鼠肺组织中apelin mRNA及APJ mRNA表达。免疫组化法检测大鼠肺组织apelin和APJ蛋白表达。结果：COPD组apelin、APJ mRNA相对表达量显著低于对照组（P ＜0．01）。大鼠肺组织apelin、APJ mRNA 表达与 RV/（LV ＋ S）均呈负相关（r ＝-0．454、-0．448，均 P ＜0．05）；与 FEV0．3/FVC 呈正相关（r ＝0．529、0．475，均P ＜0．05）。 apelin、APJ蛋白主要表达在支气管肺组织上皮细胞、肺泡巨噬细胞、血管内皮细胞及部分肺泡壁细胞的细胞膜和细胞浆，COPD组及对照组apelin、APJ蛋白均呈阳性表达，半定量检测COPD组表达低于对照组（P＜0．05）。结论：apelin及其受体APJ的 mRNA和蛋白在COPD大鼠肺组织表达均下降，可能是导致大鼠COPD肺动脉高压、肺心病发生发展的重要因素。 apelin-APJ系统可能成为探索防治COPD肺动脉高压、右心室肥大的新靶点。
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CRL F2实时定量PCR检测方法的建立及初步应用
目的：建立人细胞因子受体样因子2（CRLF2）实时定量 PCR检测方法。方法设计特异性引物扩增目的基因CRLF2及管家基因ABL ，将纯化的PCR产物进行TA克隆，经菌落PCR筛选并测序鉴定后，提取重组质粒DNA ，紫外分光光度计检测浓度换算成copies／mL浓度，稀释制备成质粒标准品，制作标准曲线观察灵敏度和线性范围，同时对质粒标准品的稳定性进行评估。初步应用该方法检测10例健康儿童和10例急性淋巴细胞白血病（ALL）初诊儿童的骨髓单个核细胞CRLF2水平。结果 CRLF2 PCR产物具有单一特异的熔解曲线；标准品的线性检测范围为103～108 copies／mL ；质粒标准品反复冻融3次仍旧稳定；临床标本的 CRLF2水平均在标准品线性检测范围。结论该实验室建立的 CRLF2实时定量 PCR检测方法具有良好的特异性、线性范围和稳定性，可应用于临床 ALL 儿童CRLF2基因的定量检测。
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NF-κB与MTA2在乳腺浸润性导管癌中的表达及相关性研究
目的 探讨核转录因子κB(NF-κB)与肿瘤转移相关基因2(MTA2)在乳腺浸润性导管癌组织中的表达及其相关性,并分析其与乳腺浸润性导管癌临床病理参数之间的关系.方法 采用实时定量聚合酶链反应检测68例乳腺浸润性导管癌患者的癌组织及配对癌旁正常乳腺组织中NF-κB与MTA2基因的表达情况,并分析其与各临床参数的关系.结果 NF-κB和MTA2在乳腺浸润性导管癌组织中的表达都与年龄、肿瘤大小及组织学分期等指标无关(P＞0.05);与淋巴结转移及TNM分期等指标有关(P＜0.05).此外,MTA2在乳腺浸润性导管癌ER阳性患者组织中呈高表达(P＜0.05).乳腺浸润性导管癌组织中NF-κB与MTA2的表达呈正相关(r=0.808,P=0.012).结论 检测NF-κB与MTA2在乳腺浸润性导管癌组织中的表达水平,可为乳腺浸润性导管癌的诊断,侵袭转移程度和预后提供理论依据.
关键词： 乳腺浸润性导管癌 真核转录因子-κB 实时定量聚合酶链反应
