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电针胃经经穴促进大鼠胃黏膜修复过程中相关蛋白磷酸化的研究
目的:探讨电针促胃黏膜修复过程中对相关蛋白磷酸化的影响.方法:20只SD大鼠分为空白组、模型组、针刺非穴组和针刺穴位组,每组5只.使用无水乙醇灌胃法制作大鼠胃黏膜损伤模型.针刺非穴组取"足三里""梁门""四白"穴旁的对照点,针刺穴位组取"足三里""梁门""四白"穴,每次电针30 min,每日1次,共治疗7 d.对大鼠的胃黏膜细胞分别进行磷酸化抗体蛋白芯片检测,同时筛选720种磷酸化蛋白的表达差异,并进行比较.结果:模型组胃黏膜损伤指数与空白组比较显著升高(P＜0.01);针刺穴位组胃黏膜损伤指数低于模型组和针刺非穴组(P＜0.01),而与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).蛋白芯片分析示:针刺穴位组与针刺非穴组均可上调模型大鼠的蛋白磷酸化的水平(≥1.5倍),但针刺穴位组上调的蛋白大多数参与了细胞的增殖,而针刺非穴组只有几种蛋白参与细胞增殖;同时针刺穴位组与针刺非穴组还可下调蛋白磷酸化水平(≥1.5倍),且针刺组下调的蛋白参与抑制细胞凋亡,而针刺非穴组下调的蛋白基本不参与细胞活动.结论:电针足阳明胃经穴可引起大鼠胃黏膜损伤后修复信号蛋白的磷酸化水平发生变化,提示电针促进胃黏膜修复的机制与胃黏膜损伤后修复信号蛋白的磷酸化有关.
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EBP50抑制HeLa细胞增殖及基质金属蛋白酶表达
与膜-细胞骨架连接蛋白(ezrin-radixin-moesin,ERM)家族结合的磷酸化蛋白50(ERM-binding phosphoprotein-50,EBP50)与肿瘤细胞迁移和增殖有密切关系,但各个研究者对EBPSO在肿瘤中所起的具体作用尚存争议[1-2].
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幽门螺杆菌感染后人胃腺癌上皮细胞微量磷酸化蛋白质差异分析
目的 研究幽门螺杆菌(Hdicobacterpylori)作用后人胃腺癌上皮细胞(AGS)中微量磷酸化蛋白的变化情况.方法 采用金属离子亲和吸附富集技术富集幽门螺杆菌与AGS细胞相互作用以及AGS细胞的磷酸化蛋白,除盐纯化后利用二维凝胶电泳技术分离磷酸化蛋白,MALDI-TOF/TOF质谱答定确认蛋白.结果 幽门螺杆菌作用后AGS细胞有21种蛋白出现差异表达,其中15种蛋白表达量下调,4种蛋白出现新表达,1种蛋白表达量上调,1种蛋白不表达.差异表达蛋白涉及细胞的钙离子调节、转录、翻译、蛋白折叠与运输、核糖体的装配、中心体复制、染色体稳定、细胞结构形态、细胞增殖与凋亡等.结论 幽门螺杆菌能引起广泛的胃腺癌黏膜上皮细胞蛋白磷酸化特征的变化,这种变化谱特征对进一步伞面认识幽门螺杆菌的致病作用有重要意义.
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蛋白磷酸化检测技术在肝细胞癌中的应用
蛋白磷酸化检测技术的临床应用有助于肝癌标记物的筛选以及肝癌发病机制和磷酸化蛋白治疗靶标研究.临床资料1.样本采集:12例肝细胞癌标本来自2008年5～8月大连医科大学附属第二医院普外科手术切除标本,标本采集经伦理委员会讨论通过.所有病例均经术后病理确认.其中男性8例,女性4例,年龄47～56岁,平均51岁.标本置于-80℃冰箱保存.
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磷酸化蛋白PED/PEA-15在肝细胞肝癌中的表达及临床意义
本研究利用蛋白磷酸化检测技术筛选和鉴定肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma HCC)组织中的磷酸化蛋白,检测到磷酸化蛋白PED/PEA-15在肝细胞肝癌组织中表达,进一步利用Western blot检测PED/PEA-15(s-116)在肝细胞肝癌的表达情况.
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曲妥珠单抗对HER-2胞外域水平不同的肿瘤细胞系的影响
目的 探讨曲妥珠单抗(trastuzumab)对细胞膜p185人表皮生长因子受体2(HER-2)强阳性表达,以及HER-2胞外域(ECD)水平不同的肿瘤细胞系SKBR3和SKOV3细胞的生长、克隆形成及细胞内HER-2蛋白水平的影响.方法 SKBR3和SKOV3细胞经曲妥珠单抗处理后,统计细胞数目及克隆形成率.双抗夹心ELISA法检测细胞培养上清中HER-2 ECD水平,Western blot检测细胞HER-2蛋白水平.结果 高HER-2 ECD水平的SKBR3细胞生长及克隆形成率明显被曲妥珠单抗抑制,在相对分子质量为90 000和40 000左右分别有1条未知磷酸化蛋白明显降低或基本消失,而细胞生长及克隆形成率未受影响的SKOV3细胞中此蛋白无明显变化.SKBR3和SKOV3细胞中p185HER-2蛋白、磷酸化-p185蛋白、磷酸化-p95蛋白水平并未见明显降低.曲妥珠单抗不仅与SKOV3细胞培养上清中的HER-2 ECD反应,也与p68/ECDⅢa蛋白反应.经曲妥珠单抗处理后,SKBR3细胞HER-2 ECD水平明显降低,但将曲妥珠单抗处理前、后的细胞数目调整到基本一致时,HER-2 ECD水平未发生明显变化.结论 曲妥珠单抗抑制肿瘤细胞生长可能与阻止相对分子质量为90 000和40 000左右的未知磷酸化蛋白表达有关;p68/ECDⅢa蛋白也可能存在曲妥珠单抗识别位点;HER-2ECD水平降低可能与SKBR3细胞数目减少有关.
关键词： 曲妥珠单抗 p185 HER-2蛋白 HER-2胞外域 磷酸化蛋白 -
活化/抑制CD59对T淋巴细胞增殖的影响
目的:研究活化/抑制CD59分子对T细胞增殖的影响.方法:Jurkat细胞分别电转入pSUPER-siCD59质粒及用CD59活化抗体刺激.激光共聚焦显微镜下观察细胞的电转情况及CD59分子在细胞膜上的分布及表达;MTT比色法检测细胞的增殖.Western blot检测CD59分子表达及T细胞活化相关蛋白ZAP70磷酸化水平.结果:激光共聚焦显微镜下可见电转染细胞表达绿色荧光,转染效率约为40％.转染pSUPER-siCD59质粒后CD59荧光强度强度降低,CD59分子均匀分布于细胞膜与正常Jurkat细胞分布一致.抗体活化后CD59在细胞膜成簇状分布.抗体活后细胞增殖速率和磷酸化ZAP70的蛋白表达水平均高于正常组(P＜0.05),而细胞电转质粒后则恰恰相反.结论:CD59通过与信号转导分子的相互作用促进T细胞活化增殖.
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人胃上皮细胞中幽门螺杆菌CagA相关未知磷酸化蛋白和磷酸化位点分析
背景:细胞毒素相关基因A蛋白(CagA)是Ⅰ型幽门螺杆菌(H.pylori)的主要毒力因子.H.pylori胃癌、胃炎相关株和CagA缺失(△CagA)株的蛋白质组学研究尚未发现CagA相关生物标记蛋白.目的:分析H.pylori CagA 阳性株和△CagA株作用后人胃上皮细胞中差异表达的未知磷酸化蛋白和磷酸化位点,为研究CagA的致病机制提供线索.方法:以金属离子亲和吸附富集技术富集经H.pylori标准株和△CagA株作用4 h的人胃腺癌细胞株AGS 的磷酸化蛋白,双向电泳(2-DE)分离蛋白,飞行时间质谱(TOF-MS)技术鉴定差异蛋白点.结果:H.pylori标准株作用后,AGS细胞FAM50A蛋白276位丝氨酸发生磷酸化,PQBP1蛋白227～251序列中有磷酸化位点.与H.pylori标准株相比,△CagA株作用于AGS细胞可引起至少13种未知磷酸化蛋白的变化,其质谱图中均出现中性丢失峰,其中2种表达量增加,4种表达量降低,6种消失,1种新发生磷酸化.结论:CagA阳性H.pylori感染可致AGS细胞FAM50A和PQBP1蛋白发生磷酸化.所发现的13种未知磷酸化蛋白为揭示CagA的致病机制提供了线索.
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质谱技术分析磷酸化蛋白的研究进展
蛋白质的可逆磷酸化是重要的翻译后修饰之一,几乎参与生命活动的所有过程.虽然对于磷酸化蛋白的全面解析还存在巨大挑战,质谱已逐渐被人们认为是挑战这一领域的有利工具.质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法包括利用抗体免疫沉淀、磷酸化蛋白胶染色、固定化的金属亲和层析柱、化学标签、强阳离子交换等技术富集磷酸化蛋白或肽段,串联质谱、电子俘获分析等技术检测磷酸化肽段并鉴定磷酸化位点,以及同位素标签对蛋白质磷酸化水平进行定量等.
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磁刺激通过星形胶质细胞磷酸化蛋白影响星形胶质细胞迁移
目的 研究1.0 Hz 60％大刺激强度的磁刺激通过调控星形胶质细胞磷酸化蛋白(PEA-15)对星形胶质细胞迁移的影响.方法 取第3～4代体外分离培养的大鼠星形胶质细胞,分为对照组、转染组、磁刺激组和转染+磁刺激组.对照组进行阴性siRNA转染,转染组应用化学合成的siRNA进行脂质体瞬时转染,干扰PEA-15的蛋白表达;磁刺激组的星形胶质细胞在铺板24 h后接受60％大强度磁刺激;转染+磁刺激组进行PEA-15的siRNA转染,并给予60％大强度磁刺激.用细胞划痕试验检测星形胶质细胞的迁移程度,用免疫印迹试验检测PEA-15的蛋白表达和磷酸化水平变化.结果 ①PEA-15 siRNA的转染效果明显,Western Blot检测与对照组比较,PEA-15的蛋白表达明显降低.②体外划痕实验中,转染组、磁刺激组、转染+磁刺激组的细胞迁移面积分别与对照组比较,其星形胶质细胞迁移程度增加,差异均有统计学意义(P＜0.05).③与对照组相比,磁刺激组的PEA-15磷酸化明显增加.结论 干扰PEA-15表达后的星形胶质细胞迁移增加明显;磁刺激可通过增强PEA-15磷酸化促进星形胶质细胞的迁移.
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Stathmin调控细胞的研究进展
Stathmin蛋白是一种磷酸化蛋白,在大的组织和物种中,均广泛存在,表达于细胞质内.Stathmin在脊椎动物的进化过程中表现的极其保守,人和大鼠的Stathmin的蛋白序列中只有一个氨基酸的差别,这说明其在哺乳动物细胞中有重要的作用.
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STAT3及其磷酸化蛋白在复发性流产中的作用
目的 探讨STAT33及其磷酸化蛋白(p-STAT3)在人类不明原因复发性流产中的作用.方法 采用Western blot法、免疫组化检测20例原因不明的复发性流产患者(流产组)及20例行人工流产正常妊娠妇女(正常组)蜕膜中STAT3及其磷酸化p-STAT3分子的表达.结果 流产组STAT3蛋白表达水平与正常组比较差异无统计学意义(P＞0.05),流产组p-STAT3蛋白表达水平与正常组比较差异有统计学意义(P＜0.05),而流产组p-STAT3/STAT3比值明显高于正常组(P＜0.05).结论 STAT3蛋白在人类不明原因的复发性流产患者的蜕膜组织中均有表达,但STAT3的磷酸化蛋白p-STAT3及p-STAT3/STAT3在复发性流产患者中明显升高,STAT3磷酸化蛋白表达水平升高可能参与了复发性流产的发病机制.
关键词： 信号传导子和转录活化子3 磷酸化蛋白 复发性流产 -
白藜芦醇诱导HL-60细胞凋亡的磷酸化蛋白质组研究
目的 通过鉴定参与白藜芦醇(RSV)诱导人急性早幼粒白血病HL-60细胞凋亡的磷酸化蛋白质,了解介导白藜芦醇诱导HL-60细胞的凋亡机制.方法 以一定浓度的RSV作用HL-60细胞一定时段后,富集磷酸化蛋白质,通过双向电泳(2-DE)分离,质谱分析鉴定差异蛋白.结果 以100 μmol/L RSV处理HL-60细胞12h,2-DE显示同对照组比较,其磷酸化蛋白质有明显变化,经过质谱鉴定后,这些蛋白质大部分为内质网及蛋白质折叠相关蛋白.结论 内质网及蛋白质折叠可能参与了RSV诱导HL-60细胞凋亡机制.
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酸性核糖体磷酸化蛋白P0的研究进展
原核生物和真核生物的核糖体大亚基上都存在着一类与蛋白质翻译密切相关的酸性核糖体磷酸化蛋白.在真核生物它们是酸性核糖体磷酸化蛋白P0,P1,P2(acidic ribosomal phosphoproteins P0,P1 and P2),而在原核生物如Escheriehia coli体内,它们分别为L10和L7,L12蛋白,其中与P0蛋白相对应的蛋白为L10,与P1、P2蛋白相对应的蛋白为L7/L12.
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蛋白质组学技术在细胞信号传递机制研究中的应用
细胞信号传递是生命中的重要现象,蛋白质组学技术为细胞信号传递机制的研究提供了一种新的思路和尝试.采用蛋白质组学技术可以对细胞信号传递过程的差异信号蛋白、磷酸化蛋白、蛋白质的胞内分布和移位、蛋白分子的相互作用以及蛋白结构域进行细致的研究,从而阐明复杂的细胞信号传递机制.
