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一种新颖的神经胶质细胞-嗅鞘细胞
嗅鞘细胞(OECs)移植治疗脊髓损伤(SCI)已显示出良好的应用前景,不同来源的OECs体外培养时,在不同发育阶段和不同生长环境中具有不同的生物学特性.OECs具有特异性的标志蛋白,如S-100、p75NTR、GFAP等.体外培养的OECs分泌NGF、BDNF、NT-3/4、GDNF等多种促进神经细胞生长、分化和神经纤维再生的神经营养因子.将OECs植入脊髓损伤部位,该细胞能分裂增殖,并可抑制胶质瘢痕的形成,拮抗Nogo等神经再生抑制性因子的活性,包绕再生轴突形成髓鞘.由于OECs具有上述独特的生物学功能,被认为是继神经干细胞和雪旺氏细胞之后可用于移植治疗脊髓损伤的一种新颖的神经胶质细胞.
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硫酸软骨素酶ABC在中枢神经系统中促进神经再生的作用
中枢神经系统(CNS)损伤后因胶质瘢痕形成而导致神经元的轴突不能再生,功能恢复不良.胶质瘢痕的重要组分是硫酸软骨素蛋白聚糖(CSPGs),其单独或与其它细胞外基质结合,导致向损伤部位延伸的轴突在胶质瘢痕处停止,而且CSPGs在神经再生时间窗关键期末可降低轴突生长的可塑性.近年研究发现硫酸软骨素酶ABC(chondroitinase ABC,ChABC)能通过降解CSPGs,使轴突的再生能力加强,活化轴突生长的可塑性,促进CNS损伤后的运动功能恢复.本文综述了近年来ChABC对中枢神经系统神经再生和可塑性作用的研究进展.
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脊髓源星形胶质细胞胶质原纤维酸性蛋白表达抑制佳短发夹样RNA分子筛选及真核表达载体构建
背景:哺乳动物脊髓损伤后胶质瘢痕形成是神经再生的物理和化学屏障,减轻或延缓胶质瘢痕形成给损伤脊髓再生创造了有利条件.目的:设计筛选并构建大鼠胶质原纤维酸性蛋白短发夹样RNA真核表达载体.设计:观察性动物实验.单位:南方医科大学附属深圳医院脊柱外科.材料:选用Wistar大鼠25只,雌雄不拘,清洁级,体质量20～25 g.DMEM/F12、lipofectamine2000、Trizol RNA分离试剂盒;胎牛血清(Hyclone);BamH Ⅰ、HindⅢ、PstⅠ、SaⅡ、T4连接酶;质粒小提试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒;第一链cDNA合成试剂盒;兔抗鼠GFAP一抗.方法:实验于2005-10/2006-06在南方医科大学附属深圳医院完成.针对GFAP基因全编码序列设计并合成3对9 bp茎环结构19 bp干扰序列特异性shRNA模板,体外定向克隆构建特异性重组质粒真核表达载体;通过体外大鼠脊髓源星形胶质细胞GFAP表达抑制模型,脂质体介导RNA干扰分子转染,由实时荧光定量RT-PCR及western blot技术,观察RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果,筛选佳GFAP表达干扰抑制真核表达载体.主要观察指标:①序列特异性干扰shRNA模板合成;②构建特异性重组质粒真核表达载体;③体外大鼠脊髓源星形胶质细胞培养;④实时荧光定量RT-PCR;⑤RNA干扰后原代星形胶质细胞GFAP表达抑制效果.结果:序列测定证实GFAP-shRNA重组质粒真核表达载体构建成功,通过实时荧光定量RT-PCR、western blot技术筛选出佳GFAP-shRNA效应表达载体,在mRNA及蛋白表达水平抑制靶基因表达效率分别为81%、63%、56%.结论:构建并筛选成功的GFAP-shRNA效应真核表达载体,在大鼠原代星形胶质细胞GFAP表达抑制模型中能高效抑制GFAP-基因表达,为后续多靶点RNA干扰技术在脊髓损伤胶质瘢痕抑制基因治疗研究策略的应用奠定前期基础.
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大鼠脊髓胶质瘢痕形成的规律
背景:脊髓损伤后治疗不理想的原因是脊髓组织的囊变和胶质瘢痕的形成,因此,明确胶质瘢痕的发生发展规律具有重要意义.目的:观察大鼠脊髓损伤后脊髓胶质瘢痕形成的空间分布、时间规律,以及轴突变化特征.方法:采用改良Allen重物坠落法建立SD大鼠脊髓损伤模型,分别于损伤后1 d,3 d,5 d,1周,2周,4周,6周,8周,10周,12周取材.以正常饲养的大鼠作对照.结果与结论:大鼠脊髓损伤后4周开始出现致密瘢痕增生,之后瘢痕厚度平稳下降,至损伤后10周形成光滑的囊腔壁,囊腔内无胶质纤维酸性蛋白阳性星形胶质细胞,损伤区囊腔周围的胶质瘢痕内可见密集肥大的星形胶质细胞,未见神经丝蛋白阳性轴突位于囊腔内.提示脊髓损伤后4周胶质瘢痕厚度达到高峰,囊腔与残存轴突之间开始形成机械屏障,损伤后10周瘢痕厚度趋于稳定.
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靶向端粒酶反转录酶基因短发夹RNA载体的构建
背景：端粒酶反转录酶对端粒酶活化起重要作用。
目的：利用pLentilox3.7.U6载体构建靶向大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA干扰分子表达载体并鉴定其作用。
方法：选择端粒酶反转录酶基因上两段序列体外合成RNA干扰分子的正义链和反义链模板序列，经退火成互补双链，与线性化pLentilox3.7.U6载体连接、转化大肠杆菌和序列测定，应用蛋白质印迹和免疫荧光技术，在体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞模型上验证构建的干扰载体抑制端粒酶反转录酶基因表达的效果。
结果与结论：蛋白质印迹和免疫荧光检测结果表明，重组质粒干扰组中星形胶质细胞端粒酶反转录酶均呈低表达。结果证实，实验成功构建了针对大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的短发夹RNA质粒表达载体，此载体能有效抑制体外培养的大鼠脊髓星形胶质细胞端粒酶反转录酶的表达。 -
携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响
背景：端粒酶反转录酶对端粒酶的激活和活化有重要的作用，利用端粒酶反转录酶的慢病毒载体抑制星形胶质细胞表达对脊髓损伤修复的影响鲜见报道。目的：利用靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体转染大鼠星形胶质细胞，并观察端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体对星形胶质细胞凋亡的影响。方法：原代及传代培养大鼠星形胶质细胞。实验分为端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组、单纯慢病毒转染组和空白组，转染后并测其转染率，且在转染后的不同时间段测量大鼠星形胶质细胞的凋亡情况。结果与结论：端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体转染组及单纯慢病毒转染组对星形胶质细胞的转染率达85%-90%。免疫荧光染色及流式细胞仪检测显示，端粒酶反转录酶基因 siRNA 慢病毒载体转染组在转染后24-48 h细胞凋亡率达50%-60%。在单纯慢病毒转染组及空白组细胞凋亡率并无显著改变。结果说明，携带端粒酶反转录酶基因siRNA慢病毒载体可促进大鼠脊髓星形胶质细胞凋亡。
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RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定
背景：端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase，TERT)对端粒酶活化起重要作用，但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。
目的：构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体，并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。
方法：通过设计合成出shRNA-TERT序列，经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒，经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞，包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度，再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞，实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平，并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。
结果与结论：基因测序鉴定证明，pLentilox3.7U6-TERT 重组质粒构建成功，并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明，Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后，对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%，Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实，实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒，感染大鼠脊髓星形胶质细胞后，该载体可以有效抑制TERT的表达。 -
控释神经营养因子与细胞移植减少损伤脊髓的胶质瘢痕
背景：前期研究发现控释胶质细胞源性神经营养因子与骨髓间充质干细胞源神经元样细胞联合移植可有效促进猕猴脊髓损伤后运动功能和感觉功能的恢复。
目的：观察控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植抑制猴脊髓损伤后胶质瘢痕形成的作用是否优于单纯细胞移植。
方法：取12只恒河猴，采用改良Al en氏法制作急性重度脊髓损伤模型，随机数字表法分为3组，实验组以控释胶质细胞源性神经营养因子联合自体骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植修复，对照组以自体骨髓间充质干细胞源神经元样细胞移植修复，空白对照组以磷酸盐缓冲液修复。修复后5个月，取出脊髓组织制成石蜡标本，应用免疫组织化学染色显示胶质瘢痕的形态特征、构成特点及瘢痕中神经纤维的再生情况，检测胶质瘢痕面积及胶质纤维酸性蛋白染色的平均吸光度值。
结果与结论：脊髓损伤部位胶质瘢痕由混合性增生的星形胶质细胞和组织细胞构成。空白对照组脊髓胶质瘢痕累及范围广，星形胶质细胞增生显著，神经丝蛋白免疫组织化学染色阴性，胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白染色平均吸光度值高于实验组与对照组(P<0.05)；实验组、对照组脊髓胶质瘢痕累及范围较局限，神经丝蛋白免疫组织化学染色显示有少量神经纤维通过瘢痕区，并且实验组胶质瘢痕面积、胶质纤维酸性蛋白染色平均吸光度值低于对照组(P<0.05)。结果表明，控释胶质细胞源性神经营养因子联合骨髓间充质干细胞源性神经元样细胞移植可更强抑制脊髓损伤后胶质瘢痕的形成。 -
多发性硬化的研究进展
多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是一种慢性疾病,病理学改变是以中枢神经系统(CNS)内多处白质的炎症、髓鞘脱失和胶质瘢痕(硬化)为特征.其病因尚不清楚,在具有遗传易感性的个体中,由可能的环境因素激发的自身免疫机制被认为是重要的.MS临床疾病过程变化不定,病变在空间和时间上都是多发的.为了进一步探讨目前对多发性硬化的认识和理解,本文对多发性硬化的亚型、脑萎缩、MRI的作用以及疾病的调整及联合治疗等进行综述.
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星形胶质细胞激活与创伤性颅脑损伤研究进展
神经胶质细胞作为中枢神经系统中分布为广泛的一类细胞，对神经元具有支持、保护、营养、形成髓鞘和修复等多种功能。星形胶质细胞作为神经胶质细胞中的一种，已有大量研究证实其在创伤性脑损伤和神经退行性病变中具有重要作用。文中结合相关文献综述介绍创伤性颅脑损伤后星形胶质细胞激活的病理过程及其中潜在的细胞及分子机制。
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大麻素受体激动剂WIN55,212-2抑制脑缺血再灌后胶质瘢痕的形成
脑缺血再灌注后出现的胶质瘢痕,主要是由增殖的激活星形胶质细胞构成.研究证实胶质瘢痕不利于神经再生,由其构成的物理化学性屏障一方面会阻碍轴突再生,另一方面由激活星形胶质细胞产生的神经发育抑制因子也会阻碍中枢神经系统功能的恢复.研究表明内源性大麻素对星形胶质细胞增殖具有调控作用.为研究脑缺血再灌注损伤后外源性大麻素受体激动剂WIN55,212-2对胶质瘢痕的影响,本文使用大鼠中动脉闭塞模型,通过免疫组织化学法对样本中的激活星形胶质细胞标记物Vimentin、星形胶质细胞标记物GFAP、硫酸软骨素蛋白聚糖标记物Neurocan、以及Notch-1信号通路配体Jagged-1分子的表达进行检测.为研究药物的作用靶点,本文联合使用了大麻素Ⅰ型受体拮抗剂rimonabant.结果表明:WIN55,212-2在大麻素Ⅰ型受体的介导下,通过减少星形胶质细胞的增殖,显著降低激活星形胶质细胞上Jagged-1的表达水平,抑制了胶质瘢痕的形成.
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丝素蛋白支架对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的影响
目的 研究丝素蛋白(SF)支架移植对大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成的影响.方法 64只SD大鼠随机均分为脊髓全横断术后SF支架移植组(A组)和空白对照组(B组);术后取出脊髓组织,显微镜下观察组织病理学变化,免疫组化染色和Western blot分别检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、生长相关蛋白43(GAP-43)的阳性细胞染色和蛋白表达.结果 与B组相比,A组可见支架内少量神经纤维,胶质细胞增生不明显,GFAP阳性细胞染色和蛋白表达减少(P＜0.05),而GAP-43阳性细胞染色和蛋白表达增加(P＜0.05).结论 SF支架移植可减少大鼠脊髓损伤后胶质瘢痕形成,并可能会间接促进神经再生.
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振荡电场刺激治疗脊髓损伤的研究进展
脊髓损伤的治疗已经成为当前医学研究的热点之一。但是，由于脊髓损伤后神经通路再形成和重建的复杂性，使目前所取得的实际疗效仍然不乐观。振荡电场刺激在促进神经再生方面具有其独特的优势，并被逐渐应用于脊髓损伤的治疗。振荡电场是使直流电场的极性每隔15 min反转1次，在阳极造成脊髓轴突退化之前将其电极转化成阴极，从而促进脊髓轴突的双向生长。现就振荡电场刺激在脊髓损伤治疗应用中的研究进展进行综述。
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反应性星形胶质细胞在脊髓损伤后作用研究进展
星形胶质细胞是脊髓内主要的胶质细胞类型,广泛分布于脊髓的各个区域.星形胶质细胞在脊髓损伤后经过一系列变化形成反应性星形胶质细胞.反应性星形胶质细胞与星形胶质细胞在形态、分子表达等方面有许多不同之处,并在脊髓损伤与修复过程中起重要作用.现就脊髓损伤与修复过程中有关RAS的作用的新研究进展情况作一综述.
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多发性硬化治疗进展
多发性硬化(MS)病理学改变是以中枢神经系统(CNS)内多处白质的炎症、髓鞘脱失和胶质瘢痕(硬化)为特征.其病因尚不清楚,在具有遗传易感性的个体中,由可能的环境因素激发的自身免疫机制被认为是重要的.MS临床疾病过程变化不定,病变在空间和时间上都是多发的.现就其几种治疗方法作一综述.
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神经干细胞的研究进展
长期以来,人们一直认为,成年哺乳动物中枢神经系统内不存在神经干细胞(neural stem cell,NSC),神经细胞不具备更新的能力,一旦遇到损伤,受损的神经细胞将永久丧失,再生是不可能的,因为成熟神经细胞是不能分裂的,失去的神经细胞只能被胶质细胞所填充并形成胶质瘢痕.然而通过近10 a来的对神经生物学的研究发现,不仅外周神经可以再生,而且中枢神经损伤后也能再生修复;不仅神经纤维能再生,神经元的胞体也能再生.在成年哺乳动物的中枢神经系统中,不仅存在有神经干细胞,而且还被证实这些神经干细胞在一定的环境因素的调控下,能够在体外分裂,诱导分化成为神经元和胶质细胞;并且通过基因操作,神经干细胞可以作用载体用于神经系统疾病的基因治疗.
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反应性星形胶质细胞对中枢神经系统损伤的保护作用
胶质瘢痕抑制轴突再生的观念在过去的100年里一直占据着主导地位.近年来,越来越多分子消除技术的研究表明,反应性星形胶质细胞增生和瘢痕的形成,在中枢神经系统的损伤恢复中起到重要的保护作用,尤其是在损伤的急性期.本文将从分子水平,信号机理和胶质瘢痕等方面对中枢神经系统( center nervous system,CNS)损伤后,星形胶质细胞的作用予以综述.
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嗅鞘细胞移植治疗中枢神经系统损伤的研究进展
中枢神经系统损伤与再生的问题一直是困扰着神经科技工作者的难题.原因之一是损伤神经的再生能力极其有限,另一原因与轴突所处的抑制性胶质环境有关,同时,主要由肥大的星形胶质细胞突起和相关物质组成的胶质瘢痕为致密的网状结构,该结构的形成亦阻碍了再生轴突的延伸[1].嗅鞘细胞的生物学作用广泛,它针对中枢神经系统损伤后发生的一系列病理变化具有逆转和改善的作用,对中枢神经系统损伤具有良好的反应.本文就嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells;OECs)的特性及研究进展加以综述.
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细胞移植修复脊髓损伤的进展
脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊柱损伤的严重并发症,其治疗一直是临床工作中困扰人们的难题.SCI修复面临的主要问题是:(1)脊髓空洞、胶质瘢痕构成阻碍轴突生长的机械屏障;(2)原发和继发的神经元凋亡,使脊髓缺乏自我修复能力;(3)神经营养因子缺乏;(4)损伤局部存在抑制轴突再生的因素如Nogo、髓磷脂相关糖蛋白等[1].
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大鼠脊髓损伤局部空洞瘢痕的量化分析
目的:对脊髓损伤后形成的空洞和瘢痕进行量化分析.方法:成年雄性SD大鼠32只,随机分为术后7、14、21和28d 4组.切断大鼠T9平面脊髓制备脊髓完全横断损伤模型,术后相应时间灌注取材,切片行HE、天狼猩红染色以及GFAP(胶质细胞酸性蛋白)、NF(神经丝蛋白)免疫荧光染色.计算机图像分析测算脑膜瘢痕面积,胶质瘢痕面积,空洞直径和脊髓残端间距.结果:脑膜瘢痕面积为0.052mm2,胶质瘢痕面积为0.026mm2.脑膜瘢痕面积接近胶质瘢痕的2倍,差异显著(P＜0.05).脑膜瘢痕和胶质瘢痕主要成分均为Ⅰ型胶原.在胶质瘢痕内可见NF阳性标记的再生神经纤维,而在脑膜瘢痕中却全然没有,NF标记的再生神经纤维无法逾越脑膜瘢痕.结论:空洞和瘢痕形成了再生神经纤维无法逾越的巨大障碍,脑膜瘢痕要甚于胶质瘢痕.在脊髓损伤修复中移植桥接脊髓就成为必须.
